RT-PCR产物电泳结果只有引物二聚体，没有目的条带，更换引物了也这样，求高手解答原因啊！高分

Question

最近2个月反复做PCR跑电泳一直都是只有引物二聚体没有目的条带，

我的PCR条件是这样的

模板1ul （浓度100ng）

引物上下游各1ul （浓度10uM/L）

pcr mix 10ul （用过biotek的mix，也用过takara 的EX Taq HS）

rnafree水 7ul

94℃ 5min

94℃ 30s

55-60℃ 30s

72℃ 1min

72℃ 10min

目的条带从173到690不等

内参跑出来了而且很清晰，所以我觉得我的cdna模板没有问题，

一开始认为是引物问题，就又查阅了很多英文文献，把引物全都用Oligo7软件验证了，选择了最理想的几对引物，

现在很困惑，想请高手们帮我分析下原因，

自己也查阅过网上的解答，但是有些问题不明白

1.引物浓度问题，引物浓度过大会引起二聚体，但是我查阅过有些文章说引物的工作浓度20uM/L比较合适，所以我20ul体系各加1ul似乎不是很高啊，而且内参也是这个加的这个量，内参跑出来了

2.退火温度问题，退火温度我做过梯度，一样，都没有条带，只有二聚体

3.模板浓度问题，我的模板浓度是100ng，不知道是不是合适

4.Mg2+浓度问题，有不少文章提到Mg2+浓度对实验影响很大，但是我不知道如何调整，Mg2+应该是在我买的pcr mix里面吧？那减少mix的量？如果这样的话酶的量不是也少了么

5.引物设计的问题，我发现primer5和Oligo7验证的结果很不一样啊，primer5设计出来的引物用OLigo验证都不太好，Oligo设计出来的引物，用primer5验证都很差，所以我没敢自己设计，还是找了很多文献，用Oligo验证，我选择的几对引物中，虽然有的显示会形成二聚体，但△G都比较低，在PCR那个选项出来的结果中也都没有提示，说明应该可以接受啊。

6.有不少文献中的引物经过Oligo验证，都提示 上下游引物溶解温度差别大，所以我没有选用，我一直很困惑，很多文献的引物我验证了都不太好，为啥人家还能做出结果呢？

7.最后还有个问题就是加试剂顺序的问题，我喜欢先加水，然后加mix，然后加引物，最后加模板，这样是不是不太好，是不是应该最后加mix？

暂时这么多问题，希望大家能帮帮我，再做不出来我要崩溃了- -

补充一个问题，

8.酶效率问题，会不会是我的酶效率不好呢？预变性时间5min应该不短了吧，如果循环中的变性时间加到45s试试会不会有改善呢?

Answer 1

1. 楼上说的都很有道理。不同的Taq确实效果很不一样。在我所使用过的几十种酶中，发现凡是遇到困难的模板，Qiagen 的HOTSTART MASTER MIX PLUS一般都可以得到产物，所以我强烈推荐（可以试试配合Q SOLUTION一起使用，一般免费索取）
2. 另外就是，你的目标基因的表达量是不是很低？你的PCR目的是什么？建议先找一个表达丰度高的体系，验证一下你的引物是否工作。对于极低表达丰度的目标，一轮PCR很有可能得不到产物，这是建议使用NESTED PCR，就是设计2套嵌套的引物，第一轮先用外面的那对，理论上可以得到一个比较大的产物（跑胶不一定能看到），然后稀释PCR产物50倍，再用里面那对引物扩一次，一般可以得到跑胶看得见的产物量。
3. 关于引物设计，推荐使用Primer3 plus，这是免费的网上设计软件，很好用。比你用的那2种引用次数多很多。你Google一下就可以了。追问

谢谢你的建议，巢式PCR的话又要重新设计引物了，本身又不是很有经验，不敢自己设计，文献上几乎报道巢式PCR的引物
你的目标基因的表达量应该是不高。我的实验目的是看干预以后多组之前表达量的差异，所以我比较想改做荧光定量PCR。
如果我普通PCR扩不出条带的话，改做荧光定量PCR能看到扩增么？那个比较灵敏点，低丰度的应该也能检测到吧

追答

再做定量PCR以前，你还是要验证引物是否工作。对于低丰度的目标，要采用引物加探针的方法来做。如果商家有针对这个基因的现成探针，最好。不然就把该基因目标区的序列用软件设计（一般厂家的网页都有免费设计引物+探针）。

Answer 2

个人觉得mix质量一般，mix一般是用来做检测用的，比如说提取出来了质粒做克隆鉴定啊，或者是转基因动物做基因型鉴定用的。你要用cDNA做模板的话，建议用专门的PCR的酶，这样也可以改体系中的不同组分，比如说可以把Mg离子浓度提高一些。
我建议你改用好一些的Taq酶去PCR试试，比如说LA Taq，Primer Star或者PFU什么的，保真度高。另外，你也可以试试把退火温度再降低一下，你的退火温度是在引物的Tm值附近的吗？追问

换过别的同学的Taq酶，人家能做出来的，我这个还是做不出来，LA Taq好像是扩增长片段的吧，我要的片段不大啊，还有PFU酶比Taq酶保真度高吗？我看有的人说用Taq酶做出来的用PFU酶做不出来，所以我不敢试。
如果我改做荧光定量PCR能看到扩增么？那个比较灵敏点，我觉得是不是我的基因丰度太低了

追答

只是换别人的酶试过？有没有可能是PCR中的哪个组分出问题了？
荧光定量PCR我没有做过，不清楚了

Answer 3

不要用mix试试吧！

用Taq DNA buffer、dNTPs、Mg2+、引物、TaqDNA聚合酶试试。

退火温度在40到70度间都试试。可能是退火温度已经太低了所以出现杂带。