siRNA的筛选求教

Question

如题所述

Answer 1

首先需要针对目的基因设计高效的siRNA干扰片段。一般设计3-5条siRNA，然后对目的细胞进行转染，转染后24~72 h进行表达量检测，最佳检测时间与细胞类型、转染试剂、 检测
目的等相关。
1) RNA水平的检测：采用qPCR检测方法，siRNA转染后24~72 h即可检测到
mRNA表达明显降低；
2) 蛋白水平的检测： 主要为Western Blot方法检测， 检测时间受细胞内蛋白
质表达量、 半衰期等因素的影响， 一般为48~96 h；
3) 功能筛选： 应用EdU细胞增殖、EdUTP细胞凋亡等方法进行细胞功能筛选。

Answer 2

转入质粒的原理：质粒上连的片段转录后能够自身互补形成双链（shRNA），在细胞内被细胞自己剪切成siRNA。
两种转染方法在功能上是一致的。但是siRNA转染以后发挥作用的时间较短，用于短期抑制试验（一般维持一周以内）。而因为质粒存在于细胞内比较稳定（载体上含有抗生素标记，可以筛选），能够持续表达产生shRNA，然后不断产生新的siRNA，因此维持作用的时间长（可以超过两周）。
另外用质粒还可以同时转入报告基因作为对照，确定质粒确实已经转染进去了。本回答被网友采纳