以前人们一般应用较长的dsRNA作为基因沉默的工具,但后来发现长链dsRNA特异性较差。它不仅可激活RnaseL,导致非特异性RNA降解,而且还能激活依赖于dsRNA的蛋白激酶R(protein:kinase:R,PKR),PKR可磷酸化翻译起始因子e:IF2并使其失活,从而抑制翻译起始。后来人们发现小于30bp的dsRNA即可有效引起基因沉默,并且不会产生非特异抑制现象,进一步研究表明抑制作用最强的是长21bp、3′端有两个碱基突出的siRNA。
但RNAi技术要求siRNA反义链与靶基因序列之间严格的碱基配对,单个碱基错配就会大大降低沉默效应,而且siRNA还可以造成与其具同源性的其他基因沉默(也叫交叉沉默),所以在siRNA的设计中序列问题是至关重要的。要求所设计的siRNA只能与靶基因具高度同源性而尽可能少的与其他基因同源。
设计siRNA序列应注意以下几点:①从靶基因转录本(mRNA)起始密码子AUG开始,向下游寻找AA双核苷酸序列,将此双核苷酸序列和其下游相邻19个核苷酸序列作为siRNA序列设计模板,有研究结果显示GC含量在45%55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效;
②每个基因选择45个siRNA序列,然后运用生物信息学方法进行同源性比较,例如使用BLAST(),剔除与其他基因或EST序列有同源性的序列,选出一个特异性最强的siRNA进行合成;
③尽量不要以mRNA的5′端和3′端非翻译区及起始密码子附近序列作为设计siRNA的模板,因为这些区域有许多调节蛋白结合位点(如翻译起始复合物),调节蛋白会与RISC竞争结合靶序列,降低siRNA的基因沉默效应。
如何设计有效的siRNA1.化学合成
尽管化学合成是最贵的方法,但是却是最方便的——研究人员几乎不需要做什么工作。包括Ambion和Qiagen公司都可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高,定制周期长,特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高,为一个基因合成3—4对siRNAs的成本就更高了,比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。
最适用于:已经找到最有效的siRNA的情况下,需要大量siRNA进行研究
不适用于:筛选siRNA等长时间的研究,主要原因是价格因素
2.体外转录
通过体外转录的方法可以合成siRNAs,这样的成本相对化学合成法而言比较低,是一种性价比高的筛选siRNAs的好方法。更重要的是采用这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNAs。以Silencer
siRNAConstructionKit为例,一旦得到DNA
Oligo模版(这个还是需要DNA合成的,不过DNA合成的成本就比较低了),只要24小时就可以,不需要等很久。这个方法的不足之处是实验的规模受到限制,虽然一次体外转录合成能提供足够做数百次转染的siRNAs,但是反应规模和量始终有一定的限制。而且和化学合成相比,还是需要占用研究人员相当的时间——毕竟,化学合成只需要定购就可以了。值得一提的是体外转录得到的siRNAs只要较低的浓度就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果(0.5-20nM
vs.50-100nMpertransfection)
最适用于:筛选siRNAs,特别是需要制备多种siRNAs,化学合成的价格成为障碍时。
不适用于:实验需要大量的,一个特定的siRNA。长期研究。
siRNA实验方法和设计常见问题解答Q:如何选择转染方法和转染试剂?
A:我们的siRNA适用于各种转染方法。转染方法和转染试剂的选择,需要根据细胞来选择,对于容易转染的细胞,常用的转染方法是脂质体转染。
Q:对于难转染的细胞,应该如何提高其转染效率?转染效率又该如何确定?
A:1)对于贴壁细胞,推荐采用转染试剂转染即可;2)对于难转染的细胞的转染,如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。一般建议使用电转的方法,但是由于电转的方法对细胞损伤比较大,该方法也未必是最佳的。
转染效率的确定,常用的是使用荧光标记的siRNA,通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪检测的方法。具体可以参考我们的产品说明书。
Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关?
A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法,而于siRNA的序列并没有直接关系。因此,siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。
Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜?
A:依不同的转染方法或转染试剂而定。如使用lipofectamine2000作为转染试剂,单独转染siRNA,30%～50%密度较佳;而siRNA与质粒共转染,密度可以到80%-90%。
Q:siRNA转染时的培养基要求,可否含血清?
A:不同的转染试剂可能有不同的要求,对于lipofectamine2000,在配制siRNA和lipofectamine2000混合物时不能含有血清,但细胞培养基可以含有血清,但不能含有抗生素。
Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别?
A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度,锐博推荐的贮存液浓度为20μM;而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度,一般10～100nM范围内,锐博生物推荐的转染浓度是50nM。
Q:转染时该如何分组?分组的目的是什么?
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Q:为什么说阳性对照在RNA干扰实验中很重要?
A:阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说,当您看到siRNA阳性对照的预期实验结果时,您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA提取物和检测方法是可靠的。
Q:阳性对照及其阴性对照在RNAi实验中的作用?如何选择?
A:阳性对照指的是已经验证的针对看家基因或报告基因有效的siRNA,用于监测实验体系和实验方法的可行性。我们可以提供的阳性对照siRNA有针对GAPDH,ACTB,GFP/EGFP有效的siRNA作为阳性对照,客户可以根据具体的实验需要选择。阴性对照往往是非特异的siRNA,主要用于说明siRNA作用的特异性。阴性对照的选择可以是通用的序列(universal)或是随机打乱的序列(scramble),客户可以根据实验要求选择。
Q:用荧光对照siRNA如何检测转染效率?是不是每次实验都必须做?
A:我们提供的转染对照siRNA带有Cy3或Cy5荧光标记,可以通过荧光显微镜,共聚焦显微镜,流式细胞仪等荧光检测仪器检测。除此之外,还应该通过阳性对照实验进一步确定。转染效率的高低主要与细胞自身相关,同等实验条件下,每次转染细胞转染效率应该是相近的,因此可以不必每次都做。但如果每次实验都做一个荧光对照组,将会更加便于排除一些实验问题。
Q:siRNA荧光染料的最大吸收率和发射率各在哪个波段?
A:FAM在495nm处有最大吸收率,在520nm处有最大发射率。
Cy3在550nm处有最大吸收率,在565nm处有最大发射率。
Cy5在643nm处有最大吸收率,在667nm处有最大发射率。
Q:转染后出现细胞死亡是什么原因?如何优化转染条件?
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Q:到了转染时间发现细胞密度太低,该如时转染还是让细胞多长一天再转染?
A:细胞生长需要一定的密度,而转染试剂对细胞有一定的毒性,如果转染时细胞密度过低,细胞可能会因此生长异常甚至死亡。转染前要求良好的细胞状态和细胞活性,一般也不建议用生长几天的细胞做转染。
Q:siRNA的作用效果应该如何检测?
A:通常可以从三个方面来相互验证siRNA的作用效果
3)根据目的基因的功能,从细胞表型的水平检测。
Q:siRNA在细胞内可以作用多长时间?什么时候才是最好的检测时间?
A:siRNA介导的RNAi属于瞬时现象,不能稳定传代,一般其作用时间不可能维持很长时间,通常建议在转染后34天内完成检测。最佳检测时间,因细胞、目的基因而异,多在转染后2448小时之间检测。
Q:为什么要强调mRNA水平检测?可以直接检测蛋白和功能吗?
A:siRNA直接作用于mRNA,因此mRNA水平检测是最直接在指标。
很多客户认为,mRNA的降解直接的结果应该是对应蛋白质含量的下降,因此蛋白水平的检测结果也应该可以作为有效性的检测指标。事实上,很多情况下往往出现,mRNA下降水平与蛋白下降水平不对应的现象。其可能原因有:
Q:干扰效率多高才是好的靶点?
A:没有明确的界定,干扰效率高低因不同的细胞类型和不同的基因而异。不同细胞类型的转染效率也不尽相同,不同基因的表达水平也相差较大,主要看干扰效果而定。
Q:沉默效果不理想,应该如何处理?
A:最常见的影响沉默效果的两个原因是:转染效率低和siRNA序列设计的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的细胞系,并发现沉默效果不佳,我们建议您对转染效率进行检测,并选择优化转染条件。如果您已经对实验转染条件进行优化但是问题依然存在,我们建议您换用另一种转染试剂或是采用其他技术,这也许能提高转染效率。如果已经提高了转染效率但是沉默效果仍然未达到要求,可能是因为siRNA序列设计的效果不理想。
Q:siRNA反而使得目的基因表达上调了,这是什么原因?该怎么解决?
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Q:我从阴性对照实验中得到和特异性RNAi相同的结果,这说明了什么?
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Q:各组阴性对照的检测结果是否应该一样?如果偏差很大该怎么办?
A:正常情况下,各组阴性对照的检测结果应该是相近的。如果偏差过大,只需考虑实验结果的准确性。另外,对于一些特定的基因,比如与细胞难受压力相关的基因,又如参与细胞免疫的基因,可能会对外界压力比较敏感,使得各组对照的基因表达发生变化不一致。
Q:用100nM的siRNA转染时只得到50%沉默效率,我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗?
A:当干扰效率不佳时,可以在一定范围内适当优化转染浓度,通常优化的范围是10~150nM,但不宜过大,高浓度的siRNA将可能增加非特异性作用的可能性并对细胞产生毒性。
Q:同样的siRNA,为什么在细胞A很有效,在细胞B则没有效果?
A:不同细胞的转染效率不一样、基因表达水平也不一样,这些都与siRNA的作用效率有关
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