不同细胞siRNA转染效率的检测问题

Question

(1)最近在做RNAi，用的siRNA，然后Real-Time PCR，发现抑制率仅20-30%左右，与说明书说的70-90%相去甚远，咨询相关人员后，认为可能是转染效率的问题，如果转染效率仅有20-30%， 那抑制20-30%也就不少了。因此想请教一下，一般不同细胞通常转染效率是多少？我用的是MT4(悬浮)、CEM(悬浮)、HepG2(贴壁)听说悬浮 细胞转染效率要低，原代更低，贴壁好一些，是否如此？(2)针对GFP的siRNA是不是在设计siRNA时就将GFP的表达序列设计进去？

Answer 1

博凌科为解答：1.通常情况下悬浮细胞转染效率较低，贴壁细胞的转染效率因细胞不同，有些很高有些很低。HepG2的DNA转染效率大概有50%，siRNA暂时没做过。如 果你有GFP质粒和针对GFP的siRNA共转染，用只转染GFP质粒的孔做对照，可以看出转染效率。如果没有针对GFP的siRNA就只能转染GFP质 粒，一般情况下转染DNA好的话，转染siRNA也不会差的。个人觉得细胞本身的性质决定了转染效率。2.不是的。针对GFP的siRNA和我们通常用的化学合成的siRNA一样，只不过是针对GFP基因的。

Answer 2

可以在抽RNA的时候保留DNA组分，对DNA同样作GFP的realtime，作为内参。如果质粒上除了你要抑制的基因还有其他东西转录，也可以用其他转录的mRNA做内参。
这样的比较可以排除转染效率不同的影响。