硝酸还原酶活性的测定
一、目的
硝酸还原酶（EC.1.6.6.1，缩写NR）是硝酸盐同化中第一个酶，也是限速酶，处于植物氮代谢的关键位置。它与植物吸收利用氮肥有关，对农作物产量和品质有重要影响，因而硝酸还原酶活性被当作植物营养或农田施肥的指标之一，也可作为品种选育的指标之一。通过本实验可以初步掌握测定硝酸还原酶活性的原理和方法。
二、原理
在一定条件下，NO 的生成量与硝酸还原酶活性呈正相关。NO 含量可用磺胺显色法测定，即在酸性条件下与对-氨基苯磺酰胺发生重氮反应，生成的重氮化合物又与N-萘基乙二胺盐酸盐（或α-萘胺）生成红色偶氮化合物，可在540nm下比色测定。反应如下：
硝酸还原酶活性一般采用活体法或离体法测定。离体法需将材料磨成匀浆，经过滤或离心除去残渣，以上清液为硝酸还原酶粗酶液进行测定。由于研磨中NADH受损失，必需外加NADH方可测定。活体法直接用鲜活组织进行测定。环境中的NO 进入细胞后，被硝酸还原酶还原成NO 并扩散到细胞外在溶液中积累，测定溶液中NO 的含量即可得知硝酸还原酶活性的大小。活体法不破坏细胞原有的酶反应系统，NADH可由代谢反应不断生成，无需外加。活体法简便、快速，不需要贵重仪器设备及低温条件，但重复性欠佳，应作一定量的重复。本实验采用活体法测定硝酸还原酶活性。
三、实验材料、仪器和试剂
1．材料
材料可选用小麦、玉米、白菜、油菜、烟叶等作物的叶片
2．仪器
（1）天平
（2）真空泵和真空干燥器
（3）离心机
（4）20mL刻度试管×7
（5）50mL三角瓶×3
（6）恒温水浴
（7）恒温箱
（8）分光光度计
（9）移液管：5mL × 2；2mL × 5；1mL × 1
3．试剂
（1）亚硝酸钠标准液：精确称取亚硝酸钠0.1000g，用水溶解后定容至100mL，吸取此液5mL，用水稀释定容至1 000mL，即为5μg/mL的亚硝酸钠标准液。
（2）0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液：
A液（0.2mol/L Na2HPO4）：称取35.61g Na2HPO4·2H2O（A.R），用蒸馏水溶解并定容至1 000mL。
B液（0.2mol/L NaH2PO4）：称取NaH2PO4·H2O（A.R）27.6g，用蒸馏水溶解并定容至1 000mL。
取A液84.0mL和B液16.0mL，混匀，加蒸馏水100mL。必要时用酸度计测定其pH，并用HCl或NaOH溶液校正至pH7.5。
（3）0.04mol/L KNO3：称取10.11g KNO3（A.R）溶于磷酸缓冲液并定容至500mL。
（4）1%对氨基苯磺酸：称1g对氨基苯磺酸，加25mL浓盐酸，用水定容至100mL。
（5）0.2% α ‑萘胺：称0.2g α -萘胺，加25mL冰乙酸，用水定容至100mL。
（6）30%三氯乙酸：75.0g 三氯乙酸用水定容至250mL。
四、操作步骤
1．标准曲线的制作
取6支干净试管，编号，按表1加入试剂：
摇匀后在室温下放置20min，然后在540nm波长下测定光密度，以亚硝酸含量为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线。
2．酶反应和酶活性的测定
将实验材料（如白菜叶片）用水洗净，再用蒸馏水冲洗，然后用纱布或滤纸吸干。将材料剪成0.5cm × 0.5cm左右的小块，混合均匀后分别称取三份，每份1g，然后分别放入3只50mL的三角瓶中，编号后按表2加入各种试剂：
摇匀后将三角瓶置于真空干燥器中，接上真空泵抽气10min。放气后叶片变软并沉入溶液。将三角瓶取出放入恒温箱，在30℃、暗条件下保温30min。取出后立即向2、3号瓶分别加入1mL 30%三氯乙酸以终止酶反应。将各瓶中的反应液离心（2 000r/min，10min），然后分别吸取上清液2mL于另一试管中，各加入4mL 1%对氨基苯磺酸和4mL 0.2% α-萘胺，室温显色20min后测定540nm波长下的光密度。用2、3号管溶液光密度平均值减去1号管溶液的光密度，得到的值在标准曲线上查出相应的NaNO2含量（μg）。
五、结果与计算
把在标准曲线上查得的NaNO2含量代入下式，计算硝酸还原酶活性：
六、附 注
1．真空抽气可在真空恒温箱中进行（抽气至700mmHg柱，10min），也可以在真空干燥器中接真空泵抽气。
2．酶反应要在暗条件下进行的原因是叶绿体在光合作用时可产生亚硝酸还原酶的辅酶铁氧还蛋白，与亚硝酸还原酶同时存在时可还原NO ，所以在暗条件下进行反应可阻止NO 的继续反应，以保证测定结果的准确。
3．硝酸还原酶是诱导酶，光照是其诱导条件之一，所以应在光合作用进行了一段时间以后（3h）采样，田间采样应在早晨9点钟以后。
4．无机磷对硝酸还原酶活力有促进作用，所以常用磷酸缓冲液。
5．在配制标准溶液时，加入亚硝酸钠标准液和蒸馏水后要摇匀。显色时，加入1%对氨基苯磺酸后应充分摇匀。
七、思考题
1．为什么要将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器抽气？
2．为什么1号三角瓶在加入样品之前就要先加入1.0ml 30%三氯乙酸？
参考答案
1．将加有样品和试剂的三角瓶放入真空干燥器中进行抽气、放气，重复数次，可以排出植物组织间隙的气体，使底物溶液进入叶片组织并进行酶反应。
2．由于1号瓶事先加入三氯乙酸，造成酸性条件，使得加入样品中的蛋白质（包括硝酸还原酶）变性失活，因此不会产生酶反应，可以此溶液作为对照。
http://www.scuta.edu.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy19.htm本回答被提问者采纳