在线设计引物网站有哪些-如何快速设计shRNA

如题所述

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第1个回答 2023-06-28

2022-03-16引物设计及在线验证

你设计的引物是否有用?在做实验之前可以做一个电子PCR

qPCR引物设计+在线验证

方法一:NCBI上-probe

1.之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物,上面会给出上下游序列。比如搜索小鼠nanog基因,它给出了这样的两条引物:

上游引物:TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT

下游引物:ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT

方法二:Primer3web

参考:Primer3web在线引物设计--2分钟学会步骤极简的引物设计!-哔哩哔哩()

2.1.寻找基因序列

以humanp53为例进行引物设计。

PubMed官网:

第一步:下拉条目选择核苷酸(Nucleotide)

第二步:输入基因+物种+mRNA(例如:p53humanmRNA)

第三步:点击搜索(Search)

第四步:单击选择左边栏的(mRNA4.782)

第五步:单击进入第一条(Homosapiens_mRNA_for_P53,completecds)为我们所寻找的p53humanmRNA

第六步:单击选择Features中的CDS选项

第七步:单击选择FASTA格式就会出现这个基因的CDS系列

2.2.开始设计引物

Primer3web官网:

进入Primer3web官网后,执行以下操作:

第一步:下拉条目选择物种(HUMAN)

第二步:在输入框中输入刚刚复制来的CDS序列

第三步:单击获取引物(PickPrimers)

第四步:引物序列输出;在最终结果中,有四对引物供选择。

选择合适的引物:怎样算合适?

首先看看引物的就是扩增长度,100~300bp间比较好扩增;

引物长度在20~25bp较好,而且上下游引物间不要相差超过5bp;

再就是看看Tm值,60℃左右,相差不要超过1℃。

再加一点:

既然是设计qPCR引物,那么一定要跨外显子设计,这样可以避免基因组DNA的影响CT值,如果没有跨越外显子,则扩增出来的溶解曲线CT值就会偏小。那么怎样知道自己设计出来的引物有没有跨外显子设计呢?

答案是可以根据自己设计的引物所在的基因组位置去和NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行对比。直接看那个基因的mRNA的join位置即可。

方法三:NCBI-BLAST-primer-blast

以上引物设计完成后还要自己手动去查找引物是否跨越了内含子,太麻烦了。那么再普及更方便的办法。

参考:

3.1:在NCBI上找到目的基因的mRNA序列

打开NCBI主页面,选GENE,输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属,打开-》显示基因信息,找到“mRNAandprotein”前面那个NM***********,号码复制下来。

注意:这个时候会看到有很多条NM****信息,表示这个基因不同的isoform,通过查找文献以及这些基因序列后面的解释来确定。如果不清楚,一般选择最长的那条。

3.2:开始设计跨越外显子的引物

打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站,将上面复制的mRNA编号输入序列框中,下拉选项中选择你的物种,然后在Exonjunctionspan下拉框选择Primermustspananexon-exonjunction,设置引物长度最小和最大值,然后点击Getprimer。就可以跳到Primer-BLASTResults页面。这个过程会有点长,稍微等一下。出来后,里面有个Graphicalviewofprimerpairs那一栏,会告诉设计出来的几对引物分别跨越了哪几个外显子。

在这些跨越外显子的引物对中选择最好的那对:

a).一对引物中只要有一个引物跨越了外显子就可以了。(因为一个引物跨了内含子,这条引物就不会和基因组DNA匹配,就算另外一个引物和基因组DNA匹配了,一条引物是扩不出来东西的。因为一条引物扩增达不到指数增长,扩了几十个循环后,信号就被指数增长的正确匹配的信号给掩盖了。就像在普通PCR中,只加上游或者下游引物,PCR出来绝对是没有东西的。因为产量太低了。)

b).一对引物之间的距离不要太长,因为扩增产物要求在100-300bp之间比较好,过长会影响CT值变小。

验证自己设计的引物PCR出来什么东西呢?可以做一个电子PCR看看。

1.UCSC-Tools-In-SilicoPCR

进入UCSC,选择Tools的In-SilicoPCR,输入上下游引物,target选择genomeassembly,点击submit,或者如果这样出不来,记得勾选FlipReversePrimer。因为可能上下游弄反了。提交后顺利的话,会出来一大段序列,上面会告诉你这个电子PCR做完后产出的序列在染色体上的位置及起止长度.然后再NCBI的gene选项输入自己PCR的目的基因,看看目的基因的起始位置,就知道这个PCR出来的是不是目的基因序列了。

注意:OCR产出的序列只可能是目的基因的一部分,对比一下序列起始位置就知道了。因为设计引物时是用目的基因设计的,PCR出来的是两条引物之间的序列。

进入NCBI-BLAST-primerBLAST;或者直接进入这个网址:Primerdesigningtool()

在primerparameter输入你刚刚设计的上下游引物

在database下拉选项选择RefseqmRNA

再点击Getprimer;

等一会,会卡一会才出来。

出来了一个Detailedprimerreports;上面写了Productsontargettemplate都是Homosapienstumorproteinp53(TP53)的不同转录本,且出来的产物长度也一样。说明这对引物扩增出来的就是这个基因。

两种验证方法优缺点:

UCSC验证方法可以检验你扩增出来的所有序列;

而NCBI的BLAST只能给出扩增出来的东西是不是你要的基因,以及扩增出来的产物的长度。

选择:建议使用NCBI-BLAST-primer-blast方法设计引物,也用NCBI-BLAST-primer-blast方法验证你设计出来的引物。

【技术分享】qPCR引物设计有妙招-知乎()

例如:Syt4(mouse)这个基因设计qPCR引物

step1:进入NCBI-GENE,找到这个基因的mRNA的NM*****号

step2:将这个号输入NCBI-BLAST-primer-blast输入序列框中,勾选相应条件;,且限制了PCR产物长度在70-300之间;由此设计出了10条跨内含子的引物,由Tm条件等选出了第二对引物:

上游:GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT

下游:CCAACCGTCCAATCACCTCA

step3:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框中,点击Getprimers,发现这对引物扩增出来的基因就只有Syt4基因,说明这对引物特异性很好。

step4:进入UCSC-Tools--In-SilicoPCR,输入上下游引物,点击提交,即可。如果跳转出来没有产物,则重新返回调整一下参数,比如说target参数,FlipReversePrimer:是否勾选等。最终产物是Syt4,长度220bp。说明这对引物的PCR产物特异性很高,只有这一个产物。

step5:进一步验证:由于设计引物时跨越了内含子,且已经提醒我是上游引物跨越了内含子,于是我进入NCBI-Nucleotide输入:Syt4MusmusculusmRNA,点击搜索,然后点击左边栏目中的mRNA,然后点击第一条........参考以上2.1步骤,寻找这个基因的CDS序列,找到CDS序列后,搜索这两条上下游引物,发现在CDS区域中,且这对引物的PCR产物序列也在CDS区域中,仔细查看发现上游引物所在位置是1203-1224,确实跨越了两个外显子:exon1098..1218和exon1219..3901.

以上我们设计出了Syt4这个基因的qPCR引物序列。可以直接让公司合成了。

以上所讲的都是qPCR的引物设计,一般扩增出来的基因产物都只有100-300bp之间,用于定量或者半定量。但是如果想要扩增全长DNA,则用到Primer5软件。扩增产物的长度可以自己在上面设置。

如何使用PrimerPremier5软件设计PCR引物-百度经验()

如何快速设计shRNA

在研究基因功能中,RNAi由于可以特异地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验的强有力工具。其中shRNA慢病毒载体应用颇广,今天小编告诉大家2种方法可以快速设计构建到慢病毒载体中的shRNA。

1.Sigma网站

Sigma公司做了一个针对人和小鼠的shRNA库,而且部分基因的shRNA序列经过验证,因此直接使用Sigma公司已验证过的RNAi序列最为方便。

首先打开网址:

,以Fli1为例,直接输入基因名,点击search,出现以下界面:

在Products中找到并点击shRNA选项,然后出现这个界面:

点击“MISSIONshRNALentiviralTransductionParticles”这一行的PRICING,这时会弹出界面展示针对目的基因的shRNA:

当出现时,恭喜你,这个基因有被sigma验证过,下拉可以找到验证过的shRNA,用来构建慢病毒,简单有效,敲减效率基本上是有保证的。如果没有验证过的shRNA,则根据需要多选择几条shRNA也是一样能筛选到有效的靶点。提示:小编倾向选择CDS区的shRNA,3UTR基本不选,而且选择的每一条shRNA都会在NCBI上做BLAST,确保靶点是特异性的。Blast比对后最终确认选择下面2条FLI1基因的shRNA:

需要特别提醒,如果要构建到慢病毒载体上,合成出去的shRNA引物会根据载体有些不一样,sigma用的是pLKO.1载体,小编常用SBI的pGreenPuro(CMV)载体,两端的酶切位点是BamHI/EcoRI,设计出去的引物最终是这样的(不同shRNA替换中间红色部分):

Sense:GATCCCCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGTTTTTG

Anti-sense:AATTCAAAAACCCTTCTGACATCTCCTACATCTCGAGATGTAGGAGATGTCAGAAGGGG

2.LifeTechnologies网站

LifeTechnologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件,操作非常方便,而且设计出来的shRNA不再需要到NCBI上Blast,直接可以用的。

首先打开网站:

,在TargetDesignOptions处选中shRNA,以Fli1为例,输入Accessionnumber或Nucleotidesequence,其他条件不变:

下拉到底点击RNAiDesign,然后出现推荐的10条靶点序列:

根据Rank评星,选择其中需要的(翠花一般选择4条,不同位置各一条),点击DesignshRNAOligos:

然后在DefaultLoopSequence选择合适的序列(翠花用的载体是pGreenPuro,不需要这个序列,就默认了,后面合成引物的时候要去掉的),在CustomLoopSequence处输入CTCGAG,点击Design:

得到shRNA

提醒:合成出去的引物需要做微调,根据载体的要求,和sigma的设计一样,需要在前后加上酶切位点的,最后大功告成。