第七节 致畸试验
掌握致畸试验的内容。致畸试验（teratogenic test)：是鉴定动物致畸物的标准试验法，下述的致畸试验方案用以检测药物的致畸性，也能得到有关药物致胚胎死亡及生长迟缓的资料。一、实验动物理想的致畸实验动物对药物的代谢过程应与人相近，胎盘结构亦相似，产仔多、孕期短、价廉、来源易及操作方便。在代谢功能与解剖结构方面，比较符合要求的动物是狗和猴；符合经济实用要求的是兔、大鼠、小鼠及豚鼠。但小动物有不足之外，如兔自发畸形率较高，有时孕期长短不定（32-36天），大鼠对致畸作用有较大耐受性；小鼠对致畸反应介于兔与大鼠之间，‘自发畸形略高于大鼠；豚鼠胎盘结构与人相近，但孕期长（6O天左右）产仔少（4只）。常用大鼠，小鼠和兔。特别是大鼠，因为大鼠自发畸形率低，胎鼠大小也适于检查。雌性动物宜用成年末怀过孕的动物。动物选择要求对药物敏感性高，而自发畸变形率低，至少采用两种动物，一种啮齿类，另一种要求非啮齿类。二、动物受孕及检查方法以大鼠为例，选用鼠龄三个月以上，体重200-250g雌鼠，饲养数天后作阴道分泌物涂片检查，以判断是否处于动情期。如涂片见有较多白色分泌物，镜检发现有较多核上皮细胞，提示雌鼠处于动情前期。大鼠性周期一般为4-5天，动情前期向动情期移行多在夜间。处于动情前期的鼠按2:1或3:2比例与同龄雄鼠同笼过夜，次日检查是否受孕。检查受孕方法有两种。一是检查阴栓，阴栓是雄鼠精囊与凝固腺分泌液在雌鼠阴道凝结而成的白色块状物，形似米粒，大鼠的阴栓很易脱落，次日可于鼠笼下的糖瓷盘内发现，小鼠的阴栓不易脱落，位置较深时用镊子撑开阴道口方能看清。二是阴道涂片检查精子，可用棉签插人阴道转动数次后拔出，涂抹在滴有生理盐水的玻片上，在低倍镜下查找精子。查到阴栓或精子即提示怀孕，检出日为孕期的“0天”，次为第1天，以此推算孕龄。受孕率在春、秋季较高（可达70％以上）夏、冬季较低(50%），所以也可采用人工控制温度（23℃左右）及光线，让雌雄动物每天同笼6小时后作阴道涂片，以提高受孕率并便于在白夭工作。三、剂量分组，给药方式及时间受试动物分为4-5组，其中3个剂量组（高、中、低），其余两组为阳性对照和阴性对照组。高剂量组应有母体毒性反应，或为最大给药量。摄食量的减少，体重增长缓慢或下降，阴道出血，流血等均是毒性反应的表现；低剂量组应为母体和胚胎毒性反应剂量。一般为临床拟用剂量的某些倍量。中间剂量应在高、低剂量组之间，剂量组间距应为几何级数，并能显示微小的毒性差别。也可用LD50的1/3-1/5为高剂量组，低剂量组用1/30-1/100LD50，按等比差在高、低剂量组间插进中间剂量，以期得出最小致畸剂量或最大无作用剂量。如已掌握或能估计人类实际接触量，也可以人实际接触量（或估计量）为低剂量组，并以其数倍（如10倍）为高剂量组。阴性对照组为溶剂（赋形剂）对照。阳性对照可用乙酞水杨酸(大鼠250mg/kg,小鼠150mg/kg),维生素A(浓鱼肝油5m1/kg)。家兔可用6-氨基烟酰胺（2.5mg/kg）。已经进行过致畸试验，并确知所用的试验动物对致畸物有阳性结果的实验室可略去阳性对照，每组受孕动物数大鼠和小鼠15-20只，兔8-10只，狗和猴3-4只。染毒途径应根据受试物的性质及人类可能的接触方式而定，一般多用灌胃和腹腔注射。染毒时间应选择胚胎对致畸物的易感期（器官形成期）。大、小鼠和兔进行致畸试验的日程安排见。每只试验动物在试验期间都应有准确记录受精日期，给予受试物日期和剂量，给药后动物的体重应每隔3-4天称一次（0,3,7,10,13、16,20），并根据体重调整给药剂量，，另一方面也可对受试物动物受精后怀孕与否及受试物对胚胎发育有无影响作出初步估计，如怀孕胚胎发育正常，则受试动物的体重可明显地持续增长；若胚胎中毒死亡或流产，母体体重则停止增长以至下降。四、观察⑴ 对母体的观察：每天检查有无中毒症状，对有流产或早产征兆者（如见阴道出血），及时处死检查。⑵对胎仔的观察：于分娩前1-2日处死受孕动物，以防止自然分娩后母鼠吞食畸形仔鼠。剖腹取出子宫和卵巢，称重辨认子宫内的活胎、死胎及吸收数，并从左侧子宫角顶端开始直到右侧子宫顶端，按顺序编号记录：然后检查和记录黄体数。活胎：完整成形，肉红色，看自然运动，对机械刺激有运动反应；胎盘红色，较大。晚死胎：完整成形，灰红色，无自然运动，对机械刺激无反应；胎盘灰红色，较小。早死胎：紫褐色，未完整成形，无自然运动，胎盘暗紫。吸收胎：暗紫或浅色点块，不能辨认胚胎和胎盘。黄体：在卵巢表面呈黄色鱼子状突起，提示孕鼠的排卵数。活胎的外观畸形并记录的类型、部位及程度。将每只母鼠的2/3活胎剥去皮肤和内脏，经茜素红染色及脱水透明后，检查骨骼畸形；余1/3活胎浸人鲍音氏(Bouin)固定液，供检查内脏畸形。常见的外观、骨骼和内脏见表18-6、表18-7、表18-8。由于目前没有充分证据表明骨骼对致畸物比内脏更敏感，因此，有人主张将来自两个子宫角的胎鼠随机分配到骨骼畸形检查中。现将胎仔的外部检查及骨骼和内脏畸形检查的具体方法叙述如下：⑴ 胎仔外部检查：将处死（或深度麻醉）的试验动物剖腹暴露子宫，进行下列的检查和记录。①确定怀孕情况、顺序编号依次鉴别检查活胎数，早期死胎数，晚期死胎数和吸收胎数。②剪开子宫，按编号顺序，对胎仔逐一检查记录性别、体重、身长、尾长和全窝胎盘总量。③对活胎仔由头部、躯干、四肢、尾部进行外观检查，各部位常见的畸形见表18-6。(2)胎仔的骨骼检查：胎仔的骨骼检查是致畸试验一项重要观察内容，一般是将每窝胎仔的1/2或2/3数量留作此项检查。其具体方法如下：①将留作骨骼检查的胎仔放入75%-90%的乙醉溶液中进行固定，时间2-5天。②固定好的胎仔置于1%的氢氧化钾溶液中3-10天，直至肌肉透明可见骨骼为止。在此期间依据情况可更换1%,氢氧化钾溶液数次，每次更换溶液时将胎仔脱落的皮肤洗去。③经1％氢氧化钾溶液处理后的胎仔，用茜素红进行染色直至骨骼染成桃红色或紫色为止，一般需2-5天，必要时中间须更换新染色液数次。茜素红染色液的配制：将茜素红加人下面混合液中至饱和为止。冰醋酸 5m1纯甘油 10ml1％水合氯醛 60ml使用时取上述茜素红饱和溶液lml，加1%氢氧化钾溶液至1000ml混合配成应用液。④经染色后的胎仔置于以下透明液中1-2天。若透明不够满意时，可适当延长在透明液中的时间。透明液I：甘油20分，2 %氢氧化钾溶液3分，蒸馏水77分。透明液II：甘油50分，2%氢氧化钾溶液3分，蒸馏水47分。透明液III：甘油75分，蒸馏水25分。经上述处理的胎仔骨骼标本，可在肉眼或放大镜，解剖显微镜下观察检查。注意检查各骨骼的状态，大小，数量有无异常及骨化程度。(3)胎仔的内脏检查：经外观检查后的胎仔随机法将胎仔数1/2或1/3置于鲍音(Bouin）氏液中 固定1-2周后，即可用徒手切片观察方法进行检查，其具体方法如下：头部器官的检查一通过以下切面来进行观察检查。①戴橡皮手套取出固定好的胎仔标本，在自来水下洗去固定液，用单面刀徒手沿口经耳作一水平切面，这一切面将口腔上下愕分开，主要检查有无愕裂，舌缺或分叉。②把上述切面切下的颅顶部，沿眼球前沿垂直作额状切面，这一切面着重检查鼻道有无畸形，如鼻道扩大、单鼻道等。③沿着眼球正中垂直作第二额状切面，检查眼球有无畸形，如少眼，小眼，无眼。检查有无脑积水，有无脑室扩大。④沿眼球后缘垂直作第三个额切面，检查有无脑水肿积水，有无脑室扩大。胸腔、腹腔和盆腔检查沿胸、腹壁中线和肋下缘水平线作“十”字切开胸腹，暴露胸腔、腹腔及盆腔内的器官，然后逐一检查各主要脏器的位置、数目、大小匀称性及形状等有无异常。五、结果评定主要计算畸胎总数和畸形总数。在计算畸胎总数时，每一活胎仔出现一种或一种以上畸形，均作为一个畸胎。计算畸形总数时，在同一活胎仔出现一种畸形，作为一个畸形计算，如出现两种或两个畸形，即作为两个畸形计算，并依此类推。计算畸胎总数和畸形总数的同时，必须考虑其有无剂量一效应关系，更重要的是按下列指标与对照组进行比较：1．对各组母动物需统计如下指标⑴ 交配成功动物及交配率。⑵ 死亡动物数及死亡率。⑶ 剖检母动物的平均体重及孕期体重增长值或母体增重。母体增重（g）＝处死时母体体重-妊娠第6日体重-处死时子宫连胎重⑷ 母体畸胎出现率，主要根据出现畸胎的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。计算出现畸形母体数时，同一母体不论出现多少畸形胎仔或多种畸形，一律按一个出现畸形胎仔的母体计算。2．对各组胎仔需统计如下指标⑴ 平均活胎数及活胎率⑵ 吸收胎数和吸收胎率⑶ 死胎数和死胎率。⑷ 外观畸形率、骨骼畸形率、内脏畸形率3．实验组及对照组的数据进行统计学分析不同指标用不同的显著性检验方法处理。平均体重、平均黄体数、平均着床数、平均活胎数、平均活胎体重用t检验：妊娠率、交配率、受孕率、活胎率、用χ2检验；胎吸收率、死胎率、畸胎率用非参数统计。可能时计算剂量一效应关系。根据上述指标计算后，最后评定结果，确定此种受试物是否具有致畸作用，尚要注意下列间题：(1)致畸作用具有剂量与效应关系，所以，对任何畸形的出现是否具有剂量一效应关系应该充分考虑‘更重要的是必须经过统计学处理，肯定试验组出现致畸胎的母体显著高于对照组，并且试验组动物活胎仔出现的畸形率应显著高于对照组，才可考虑其致畸作用。(2)每个实验室应掌握所用试验动物长期以来的自然畸形发生情况，包括自然出现的畸形类型和频率。试验组动物出现的畸形，如长期以来在对照组动物未曾出现过，则对受试物致畸作用，更应认真对待；反之，则应慎重做出结论。(3)生物体常有变异现象，变异是群体中个体间的差异。特别是同一物种内一个体与另一些个体的差异。变异为基因所控制，具有适应和进化的意义，与外来化合物干扰胚胎正常生长发育所引起的畸形完全不同，有人认为肋骨椎骨数目比正常多一个或少一个等现象皆属于变异，不能做为致畸。但变异出现率一般较低，也不呈现剂量与效应关系，借此可将两者加以区别。(4)致畸作用中存在种属差异，而且同种动物的品系间亦有差异。因此，在一种动物出现致畸作用后，最好在另一种动物再进行试验或至少在同种动物再重复进行试验。如结果一致，才可以认为对动物确有致畸作用。⑸ 由于致畸作用存在种属差异，所以任何外来化合物对动物具有致畸作用，不一定对人类致畸。一方面应进一步进行人群流行病学调查，以确定其在人体的致畸作用；另一方面应认识致畸作用是外来化合物的毒性表现的一种。凡是对动物具有致畸作用的化合物，也应看作对人体致畸的可能，故应采取各种措施，使人类尽量减少与其接触，这一问题涉及动物致畸试验结果推论到人的问题。动物试验结果推论到人的间题，目前在毒理学中极为重视面研究也极为活跃。虽然有人提出许多方法或途径，但迄今为止，还没有建立一个简单的方法，将动物试验结果推算到人。致畸作用也是如此，绝对不能简单地将小鼠，大鼠或其它动物的实验结果直接应用于人。现参考欧洲经济共同体和经济合作开发组织所建议的致畸物分级标准，且加以综合。注意其在实际工作中仅能做为参考，必须结合实际情况，分析思考，灵活运用。(6)将一种外来化合物对人类的致畸作用进行最后评定，决定取舍时，应该特别注意人类实际接触剂量的问题。有许多药物达到一定剂量，都可以呈现致畸作用，例如作为药物的水杨酸制剂，可引起畸胎，反应停能使很多动物致畸。甚至有些人体需要的营养素，例如维生素A，在一定剂量上，也具有致畸作用，并常常作为致畸试验中的阳性对照物。所以，任何外来化合物以一定剂量，在一定的胚胎发育阶段，与一定的动物种属接触，都可干扰胚胎的发育，并可能造成畸形。对一种外来化合物是否具有致畸作用，进行最后评定，并据此而考虑是否允许使用，应该充分考虑可能与人体接触的实际剂量和接触的方式与途径，尤以剂量最为重要。
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致畸试验
第七节 致畸试验
掌握致畸试验的内容。致畸试验（teratogenic test)：是鉴定动物致畸物的标准试验法，下述的致畸试验方案用
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