PT,APTT凝血实验检查均使用静脉血.采血人员应技术熟练,以防止组织损伤,外源性凝血因子进入针管. 2.凝血实验标本最好不与其他实验一起采集,否则由于标本的分配,分装等使用血液停留在针管的时间延长.一般血液采集,进入 容器至进行实验所用的时间越短,所分析的凝血因子被保护得越好.从输液三通管取出血的做法不可取.
3.取血时病人应松弛,环境温暖,防止静脉挛缩,止血带的压力要尽可能小,压力大及束缚时间长可影响局部血液的浓缩和内皮细 胞释放组织纤溶酶原活物(t-PA),后者将引起纤溶性增强,血小板短和内径应标准化,国际上推荐用21G1.5或20G1.5 针头.取血时,拉针栓的速度要慢而均匀,使血液平稳地进入注射器,防止气泡的产生.
4.一旦取样完毕,立即与抗凝剂充分混合,一般提倡使用真空采血管.此管有充分的透明度,根据取血量设计,有2.0,5.0 ,10ml各种血液收集管,真空负压并有定量的抗凝剂,能保证抗凝剂与取血量的比例,且能有充分的空间便于血液和抗凝剂混合.
5.用硅化玻璃或塑料注射器采血.考虑结果的精确性,应将试管刻度的可能误差控制在既定体积的10%以内.
6. 采血后标本在低温保存且在一定时间范围内.笔者曾对不同条件保存的血浆因子变化进行了探讨,结果显示在32℃保存血浆6,12, 24hⅧ因子活性可分别消失50%,60%95%,即使保存在4℃也分别消失5%,55%,70%.V因子活性在32℃分别消失 25,40,80%,而在4℃则仅损失0%,5%,10%.因此测定APTT的血浆在-80℃至少可保存1个月,4℃为6h,2 0℃为6h,而32℃仅为血浆,在4℃为24h,20℃为6h,32℃为2h.
7.国际血液学标准化委员会(ICSH),国际血栓与止血委员会(ICTH)推荐使用3.2g/dl(含2H2O)或0.109mo l/L的枸橼钠作为凝血因子检查的抗凝剂.另外,近年来,许多试验室采用缓冲抗凝剂,这种试剂对标本经冷冻保存后再行分析更为适 宜.因为无缓冲剂,血浆pH值随时间而增加,凝固时间可延长,特别是Ⅷ因子即使是在-20℃保存,其凝血活性也可减少50%.缓 冲剂的作用是维持血浆恒定pH,防止易变因子失活.抗凝剂在血标本的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度,进而影响试验结果,一定要 注意采血时血液与抗凝剂的比例.应指出,所谓血液与抗凝剂按9:1比例混合,实际上是指抗凝剂与正常压积血液之间的比例而言.因 此应根据患者红细胞比例(Hct)状况随时调整抗凝剂用量. 1. 凝血活酶应注意的问题:
(1)组织凝血活酶标准化应用的国际参考品(international reference preparation, IRP),有下列几种:单一组织凝血活酶国际参考品:是一种组织提取物的生理盐水悬液制剂.WHO在英国使用的统一标准的英国 比较凝血活酶,编号67/40.同时又以BCT67/40为基础标准化了次级参考品.如牛脑组织凝血活酶,编号68/434; 兔脑为70/178等.复合组织凝血活酶国际参考品:它是组织提取物的生理盐水悬液中加入适量纤维蛋白原,因子V和氯化钙组成的 制剂,如牛组织凝血活酶OBT/79等.
(2)组织凝血活酶工作制剂的国际敏感指数(ISI),由于不同组织凝血活酶对凝血因子 的敏感性不同.为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果,必须要制定一个共同的敏感性指标.自制的试剂要与 国际参考品(IRP)进行比较,然后得出一个校正值(即ISI).ISI值越接近于1.0,表明组织凝血活酶试剂越敏感,因此, 生产和出售得产品必须标有ISI.
(3)仪器特有的ISI:上述PT根据报告方式适用于手工法(试管倾斜法)测定PT.但是手工 法与仪器法以及仪器法与仪器法测定PT的国际标准化比值(INR)之间,仍有差异.为此,专家们提出建议:同一组织凝血活酶试剂 用于不同仪器时,可用所谓的仪器特有的ISI或称区域性ISI来计算INR.每台仪器所用的凝血活酶试剂都应该有特定的IS I值,重新标定ISI值的做法是购买标有INR的冻干血浆,然后在自己的仪器上再标定所使用凝血活酶试剂的ISI值,这样才可使 病人的INR具有可比性.
(4)某些凝血活酶和部分活化凝血活酶并不一定与某此仪器相匹配.浑浊的或含微粒的凝血活酶和部分活化 凝血活酶不能运用通过光学系统测定终点的仪器进行检测.
(5)凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步骤必须严格按照说明书进行.通 常在使用前必须充分混匀试剂,以使微粒重新均匀悬浮于液体中.按说明书要求的温度存放试剂,并且试验过程中,将试剂置于37℃下 的时间不能长于说明书中规定的温度.
(6)做APTT实验时所用的活化剂不同,对血内肝素,狼疮抗凝物质及因子Ⅷ,Ⅸ缺乏症的敏 感性也不同,要根据检测项目来选择不同活化剂的APTT试剂.同样PT延长时反遇有关凝血因子中单一因子或几个因子缺陷引起的病 理现象,由于不同疾病可能仅反映某一因子的变化,因此一种特定试剂不可能对这些疾病的变化的敏感性一致.由于不同厂家生产的PT 试剂质量不同,因此,同一份标本用不同PT试剂其结果可有明显的差异.因此PT实验最好采用INR的报告方式.
2. 试剂准备过程中应该使用去离子水.如果pH值增高的水没有得到适当的缓冲,将会延长测定结果.如果用含氨的水配制抗凝剂,会导致 V因子活性快速降低,从而延长凝血酶原时间.凝血活酶,部分活化凝血活酶,缓冲液和抗凝剂须在4-10℃条件下贮存,但在室温下 保存氯化钙和水.
3. 正常对照血浆通常将多份健康人血标本混在一起,以弥补个体误差.正常对照血浆要求20份以上健康,年龄在18-55岁间的男女个 体,且删除服药者,须在平静,休息状态抽血.样本离心取出血浆后混匀,分装小瓶,冻存于-80℃备用,或冷冻干燥.
4.参比血浆:标准化是质控的重要组成部分,方法标准化对有的实验室来说是困难的,因有设备条件方面的限制.为了使结果大同一实验室 的不同时期具有可比性,必须使用标准品或参比血浆.WHO已建立了10多种国际标准品. 1.玻璃器皿的要求:贮存和测试时应选用干净,没有划痕的试管.酸清洗法(盐酸3mol/L)被公认为适用于凝血研究清洗玻璃制品的 最佳方法.玻璃制品必须通过彻底冲洗,以去除残留的酸,避免改变容器表面的pH值.一次性玻璃和塑料制品分开保存.手工法PT或 试管法全血凝固时间测定时,试管口径为8mm,直径越大,CT越长.
2.温度的要求:人工测定终点法要求水浴箱的温度必须保持在(37±1)℃,并且周围照明设备要好,便于读取终点.如果为了读数而将 试管从水浴箱中拿出,倾斜观察,此时动作应迅速,否则试管中的血浆温度将很快下降.
3.仪器的选择:自动终点测定法有半自动和全自动两种类型,区别在于前者在试剂和血浆移液步骤上仍是手工的;而后者完全由仪器自动操 作.自动终点法测定所得结果重复性好,大大提高了不同试验室结果间的可比性.
应该根据仪器的精密度,可靠性,使用和维修的简易程度来选择所购买仪器.现在已有不少用合成底物法代替以凝固为终点的生物学测定 法的报道.但是,这两种测定方法的临床意义不尽相同. 1. 许多试验误差都来源于技术的错误.在实验技术,试剂,温度及pH值上很微小的变化都会导致试验结果明显的变化.孵育时间与温度是 在一期法凝血酶原时间测定时应严格控制的参数.血浆不能在37℃下放置超过10min,凝血活酶放置时间也不能超过说明规定的时 限.
2.手工法PT或试管法CT检查时,倾斜试管动作一定要轻,角度要小,以减少血液与管壁的接触面积.同一标本要做二管(有文献报告试 管法CT检查要3管)并取均值报告.每批实验必须有正常对照.
3.血液凝固主要是酶催化的反应,所以实验过程中要严格控制理想的pH环境和溶液的离子强度.多数常规试验都在处于血液生理pH值缓 冲范围的缓冲系统中进行.反应混合物的pH值必须处于7.2-7.4之间.
4.试验结果准确还取决于所用的反应物的量,加入顺序和不同反应物的孵育时间.如每次APTT试验时,活化部分凝血活酶试剂和血浆混 合物的孵育时间必须一致. 混匀过程决定了APTT试验中接触活化的量,在孵育时如果在活化部分凝血活酶与血浆混合的技术不佳,将会改变测定结果。
5. APTT,PT需乏血小板血浆.一般3000r/min离心10min后分离血浆.离心前注意标本量,离心后注意血浆的量(Hc t)以保证抗凝剂与标本量最适比例.
6. 试验前检查血浆是否有溶血,黄疸,脂血和出现凝块.红细胞膜含有磷脂,溶血标本具有与血小板第Ⅲ因子(磷脂)相似的凝血活性,这 种磷脂能缩短溶血血浆的APTT值.标本中如果出现凝块,无论凝块多么小,均会影响试验结果.
7.报告方式:(1)以PT的秒(s)数报告.(2)以患者PT(s)/正常对照(s)的比(PTR)报告.(3)在口服药物治疗监 控时以INR报告.(4)ICSH规定,不再用百分比(活动度)报告.(5)APTT以秒报告。 绘制质控图并随时分析其变化趋势是质量控制的重要手段.在每天工作中,同时测正常和氨基常对照血浆(商品或自制),并用Le vey-Jeuny质控图检查有无失控.其步骤为,首先在常规的实验条件下(包括高素质的实验人员,规范的操作,稳定的仪器), 对质控品至少进行10次测量,计算出X及标准差,然后绘出质控图,质控物的X值为基线,纵轴有X±2s.每次试验时质控物与标本 一起检测,并把当日的结果点在图表上.下列的质量变化图形有利于操作人员判断结果是否有所失控.当失控时,按下述步骤(图1)检 查原因.
室间质评:各实验室必须积极参加由检验中心组织的室间质评活动,以便了解本单位的结果准确性,因仪器和试剂不同,同一份质控 血浆可行到不同结果,应将回报结果根据仪器试剂分组比较.
