【动物克隆的理论基础】
在许多人眼里，体细胞克隆羊多利(Dolly)的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆(clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902年德国植物学家Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha和Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。
与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性(nuclear equivalency)或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30年代，著名的胚胎学家Spemann就已经提出“分化了的细胞核移人卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊、小鼠，牛及山羊的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。
【体细胞克隆羊及小鼠实验成功分析】
克隆羊多利是世界上第一只由成体细胞通过无性过程产生的哺乳动物。在多利诞生后的一年多时间里，全世界掀起了一股克隆热，并引起了一些激烈的争论和对多利身份的质疑。1998年7月出版的《自然》报道两个独立的研究小组分别对多利的血样、供体母羊冷冻组织及其细胞培养物进行卫星DNA分析和DNA指纹分析，确认三者的一致性，证明多利确实是体细胞克隆动物。在同期《自然》上，美国夏威夷大学Wakayama等人报道，由小鼠卵丘细胞(cumulus cells)克隆了27只存活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代。
两栖类和哺乳类核移植实验发现，经核移植的卵母细胞不能正常发育的一个关键问题是供体核和受体卵母细胞之间的细胞周期的不相容性。Wilmut等的成功之处就在于他们找到了一种使供体核和受体卵母细胞更相容的方法。他们通过血清饥饿法使供体核细胞处于二倍体的Go期，这样处理的供体核在DNA复制的时间上就与处于中期Ⅱ的受体卵母细胞同步。从建立正确的染色体倍性(ploidy)这个角度来看，供体核处于G1期也可以获得克隆动物。稳定表达半乳糖苷酶一新霉素基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得克隆牛证明了这一点。
人们一般认为，供体核和卵母细胞组成的重组胚胎的发育过程与正常状况受精卵相仿。羊胚胎基因组的转录一直到8～16个细胞才开始，这种转录时间的差异在理论上将允许胚胎有充裕的时间对植入的成体羊细胞核进行重新编程，使其进入胚胎发育期。由于不同的物种胚胎转录的起始时间各异，所以克隆的难易也不同。以往的研究发现，在小鼠的克隆过程中，基因组很早就被激活，移植的细胞核没有足够的时间进行重新编程。因此，许多研究者tk)gd,鼠是最难克隆的动物之一。
Wakayama等人的工作改变了这种观点。与Wilmut等的方法相比，Wakayama等采用了一种新的、相对简单的克隆技术。多利是采用母羊的乳腺组织细胞经过“饥饿”培养，与去核的卵细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质的重编程(reprogramming)，然后逐步发育成胚胎。克隆小鼠采用核移植的方法，将自然状态下处于G0期的卯丘细胞作核供体，直接注入去核的卵细胞。小鼠克隆过程中核移植后的重组胚胎放置O～6小时后再激活，也有异于Wilmut等用电刺激法同时融合重组胚胎和激活胚胎。多利的产生过程中遗传物质的重编程和卵细胞的激活是电刺激法，而小鼠的克隆则采用在培养基中添加锶离T-(Sr2+)和细胞松弛素B的化学方法激活重组胚胎。
【动物克隆技术的应用】
动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学、遗传学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。
动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5％的动物携带外源基因。外源基因整合入动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许
多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的机率低而难以遗传给下一代。Schnieke等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子IX的转基因羊比原核显微注射法要有效得多。其中，两者最显著的差异是体细胞克隆中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核显微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出生后才能得知，而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性地制备雌性的转基因动物，有利于在母乳中表达外源基因。
克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培育出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏症、神经损伤等多种疾病。用这种方法培育出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善，目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。
动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。
【动物克隆技术的不足及未来发展方向】
动物克隆技术虽然取得了一定的进展，在生物医药领域也得NT初步应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels等报道克隆羊的端粒较同年羊短。Renard等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。
导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支撑是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累了不少数据，但一些很基本的问题仍亟需解决。
基因组重新编程的机制尚不清楚。人们虽然观测到核移植后细胞核的激活与早期胚胎原核发育类似，但较详细的信息仍不甚明了。其中，成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)、核膜破裂(nuclear envelope breakdown，NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)在基因组重编过程中的作用还需明确。
基因印记(imprinting)对核移植后基因组重新编程的影响。基因印记现象在哺乳动物的发育过程中普遍存在，它是指基因的表达与否取7央．于它们是在父源染色体上还是母源染色体上。有些基因印记只从母源染色体上表达，而有些则只从父源染色体上表达。基因印记与动物克隆技术的成功及不足有何关系值得深入研究。
动物克隆种属及细胞差异的原因。克隆不同种属的动物难易有别，其中的原因目前人们还不清楚。目前可以用作体细胞核移植核供体的细胞类型还较少。Wakayama等用处于Go／G1期的卵丘细胞克隆得到小鼠，而他们采用处于Go期的足细胞、神经细胞作核供体进行的克隆实验均未获得成活个体，这显示核供体处于Go期并非保证胚胎发育的充分条件。Dominko等发现去核的牛卵细胞能使来自羊、猴、鼠、猪等不同种属的细胞核激活，并在体外发育为相应的胚胎，但目前还没有一个可继续发育为完整的动物个体。如果这项工作能成功，将十分有利于濒危动物的保护。
动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要作连续核移植等。
【谈谈动物克隆】
首先，何谓克隆。克隆是由klone一词音译过来的，又叫无性繁殖，也就是不需两性配子结合即可产生后代的繁殖方式，与无性繁殖相对的则是有性繁殖，高等动物和我们人类的传宗接代都属于有性繁殖，是生物进化到高级阶段的一种表现。让我们用一个具体的例子说明什么是无性繁殖?我们学校离江边很近，如果您在江边散步，会发现岸边泥土中插着很多柳条，您随意在那支柳条上折一截，再插在泥土里，过不了多久，您扦插的柳条又可发芽并长成～棵小树。这是一个非常典型的无性繁殖的例子。这样的例子在我们身边很多，《西游记》中孙悟空抓几根猴毛一吹，变成几只小猴子，这也是克隆。
1997年英国罗斯林研究所的资深科学家IanWilmut及其合作者向全世界宣布他们成功地以分化的成年母羊乳腺细胞为核供体，克隆出一只绵羊，取名多利(Dolly)这一研究结果推翻了长期以来一直认为分化的动物细胞不具备发育全能性的观点。该研究成果被列入1997年世界十大研究成果之首。这里需要解释的另一概念是细胞的全能性，简单地说全能性就是一个细胞可发育成一个个体，植物细胞具有全能性是公认的，但植物细胞具有全能性也是有条件的，举一个简单的例子，我们可以从某一株植物的嫩芽组织培养出新的植株，但我们不能从枯死的叶子中培养出一个新的植株。
其次，介绍一下克隆的过程。克隆动物有提供核即遗传物质的一方，称核供体，此外还需来自母畜一方的卵母细胞，卵母细胞最外层是一圈在光学显微镜下呈透明状的结构，称透明带，透明带内层是一层很薄的膜，称卵黄膜，卵黄膜内包着卵黄，卵黄是胚胎发育早期的营养物质，卵黄膜与透明带之间有一定的空隙，称卵周隙。克隆时可以将核供体置人卵周隙，也可将核供体直接置人细胞质内，即卵黄当中，之后采用电脉冲或化学物质刺激使核供体与卵母细胞融合，成为合子(Zygote)，随即合子开始卵裂，一分为二，二分为四，当卵裂到一定程度，即当卵裂的细胞(卵裂球，Blastermere)达到一定数目后，卵裂球中间形成一个空腔，这时候的胚胎被称之为囊胚(Blastocyst)，之后囊胚将被送人代孕母畜的子宫，一直到出生，这样出生的动物即克隆动物。这中间的问题是成功率非常低，就拿“多利”来说，当时科学家将277个经过上述过程获得的克隆胚胎送入代孕母羊的子宫，只得到一只“多利”，大家可以算一算成功的概率是多少。
第三，克隆动物的意义。“多利”的问世在世界范围内引起很大的震动；这项研究成果不仅在理论上具有重大突破，而且有非常广阔的应用前景，突出地表现在拯救濒危动物品种，甚至可以使一些灭绝的动物再世。举个例子来说，我们国家的大熊猫近年来由于植被被破坏，数目锐减，以至成为一种濒危动物。我国科学家从大熊猫身上获取细胞，并与兔卵母细胞融合，融合胚胎在体外发育到囊胚，值得一提的是，大熊猫的体重虽说是兔子体重的上百倍，但刚出生的大熊猫与刚出生的兔子体重十分接近，这种克隆与上面所介绍的克隆有所不同，这种克隆被称之为异种克隆。通过这种克隆生出的大熊猫是什么样子，现在尚无法估计，可以确定的是和正常出生的大熊猫会有所不同，因为兔子卯母细胞的细胞质中含有大量的线粒体，线粒体中的基因是编码蛋白质的，这些基因极有可能影响到大熊猫的毛色，也就是说通过这种方法出生的大熊猫可能是灰色的。
最后谈谈克隆动物出现的问题。2003年2月14日世界首例体细胞克隆绵羊寿终正寝，带给人类很多思考，这只羊仅活了6岁，而正常羊的寿命应为12～13岁。这只羊是从一只6岁母羊的乳腺细胞中克隆出来的，问题的焦点就在于克隆出来的个体不仅继承了原来的性状，也继承了原来的年龄。如果这一结论成立，这就大大地削弱克隆技术的应用价值。不久前许多媒体报道首例克隆人在以色列出生，如果上述结论成立，则可以得出这样一个结论，那就是出生的婴儿无论得到多么无微不至的照顾也将是短命的?研究者发现克隆绵羊染色体的端粒比正常羊短20％，而众所周知端粒是决定动物一生中细胞分裂次数的主要因素。
【动物基因工程良种与克隆技术】
(1)动物转基因育种技术。
自从1982年美国科学家Palmiter等将大鼠生长激素基因用微注射(microin—jection)方法转移到小鼠的卵原核(pronuclei)，获得了个体比普通小鼠大一倍多的超级鼠(Supermouse)~，充分揭示了基因转移技术运用于畜禽和鱼类育种工作的巨大潜力。由此，该技术得到了世界各国的高度重视，并激发人们把目标转向家畜、家禽和鱼类的转基因研究，并成功获得了转基因猪、牛、羊、鸡、兔和鱼等的“超级动物”。
(2)动物克隆技术。
动物克隆技术包括动物胚胎细胞克隆技术和动物体细胞克隆技术。就目前研究水平而言，两者成功机率相差很大，利用胚胎细胞克隆可能要比体细胞克隆容易一些。截至目前，全世界应用胚胎细胞克隆技术几乎成功地克隆了所有家畜，并获得了后代，而用体细胞克隆成功的报道只有羊、猴数例。从生产利用角度看，虽然运用胚胎细胞克隆与体细胞克隆技术在创造动物新品种方面都具有广阔的前景，但当前动物胚胎细胞克隆技术比较成熟，应用于畜牧业生产由一枚优良畜种胚胎重组数以千计的同基因优良种畜，在实现动物无性繁殖和胚胎生产工厂化方面具有极为重要的应用价值。
【世界首匹克隆马诞生，母马生下“自己”】
意大利克雷莫纳市繁殖技术与家畜饲养实验室6日证实，世界上第一匹克隆马已于今年5月28日在意大利诞生，这也是世界上首例哺乳动物生下它自己的克隆体。
实验室的克隆马科研小组负责人切萨雷·加利教授接受新华社记者电话采访时说，他的研究小组克隆出的雌性小马被取名为“普罗梅泰亚”。这匹小马自然顺产，出生时体重36公斤，属正常范围。加利说，母马和小马身体状况都很好，尤其是小马活泼健壮，喜好运动，平时喝母奶或吃干草饲料，现在其体重已经增至约100公斤。据介绍，克隆马计划从去年初开始进行，前后共耗资15万欧元。7日出版的英国《自然》杂志还将详细介绍这一成果。
加利是意大利知名的动物克隆专家。他曾在1999年9月克隆出公牛“加俐略”，此前还在1996年参与培育了世界上第一只体细胞克隆动物——克隆羊“多利”。在这次研究中，他们采用了母马的表皮细胞，将其细胞核注入除去细胞核的卵细胞内。研究人员总共用了800多个卵细胞，其中有22个发育成7天大的胚胎，但最后只有“普罗梅泰亚”成功诞生。
检测表明，小马“普罗梅泰亚”的DNA与其生母几乎完全相同。加利进一步解释说，用于克隆小马、培植胚胎的表皮细胞就是由生下小马的母马提供的，是世界上首次由哺乳动物生下它自己的克隆体。也就是说，“普罗梅泰亚”相当于它生母的同卵双胞胎。
加利说，与以前使用过的克隆方法相比，这次在克隆马过程中所采用的方法更容易、更实用。科研人员希望利用新技术克隆出的动物能够对疯牛病等具有免疫力，还希望这项研究能帮助人们克隆赛马和其他良种马。
曾于2001年在世界上首次克隆出濒危野生动物欧洲盘羊的意大利科学家帕斯夸利里诺·洛伊说，克隆小马的诞生在国际上是一项“了不起的成就”，在研究中所应用的技术将有助于挽救濒临灭绝的稀有马种。意大利卫生部长杰罗拉莫·西尔基也说，这是意大利科学界“一个巨大的成功”。
参考资料：http://www.xxkx.cn/Article/ShowArticle.asp?ArticleID=1089