各位高人 我想问一个问题，我将一个目的基因连接到质粒上 我想将这个质粒连同目的基因，一块扩增很多个

Question

能吗？ 用什么方法。 万分感谢。

Answer 1

能。实际上大家正是这么做的。

将一个目的基因连接到质粒上，一般用两种DNA内切酶做双酶切，使目的基因和被切开的质粒片段两端都有特异性的粘性末端，然后用DNA连接酶把目的基因与质粒片段连起来。

然后将重组质粒转化进感受态的细菌细胞中去（一般用热激法）。
由于选用的质粒上一般带有某种抗生素抗性基因（最常见的是抗氨苄青霉素抗性基因）。因此转化后的细菌没有吸收上质粒的都不能在加有相应抗生素的平板上生存。

然后在平板上挑选几个单克隆菌落进行扩增培养，质粒（以及其上的重组基因）会随着细菌的扩增而扩增。

用扩增好的菌液来抽提质粒就得到比原先多得多的目的基因拷贝数。如果用的是合适的菌种，那些菌液还可以用来诱导表达相应的蛋白质（假设这是编码原核生物蛋白的基因或者是用cDNA整出来的而且能在原核生物正常表达的基因）。

如果扩增出来的质粒没有重组基因怎么办？对抽提出来的质粒进行DNA测序就知道有没有重组基因在里面了。有时候序列会有突变，这跟选用的菌株有关，比如说JM109菌株比起DH5α菌株就较不容易让质粒序列产生突变。一般人运气不会差到5个单克隆菌落里面都没有一个有的，除非是酶切技术有问题。

Answer 2

双酶切，然后做ligase连接就好。连接的过程中会出现很多突变。

然后你把连接的产物做转化。如果有条件可以使用电激转化，这个转化的效率非常点（连接产物本来就不多，突变又多）。如果条件不够就用热激转化，热激转化的效率低一些，不如电激转化好。千万不要用TSS转化（效率太低了，只能用成型的质粒）。

转化之后你要挑选菌落，去做测序（一般交给公司），因为突变很多，一定要测序到完全正确的序列。如果没有测到，就继续挑选菌落。如果菌落挑完了，就重新转化。这段时间要多扶老太太过马路哦。

等到你得到了好的菌落，就可以培养它，提取质粒。这个量就很大了。

给你个简单的protocol
PCR 你的基因
对PCR产物，和空质粒，同时使用双酶切（分开的），加入合适的NEBuffer
使用T4ligase 和Buffer 常温1小时或者16度过夜 连接。
热激转化（电激转化还有clean脱盐）
挑去菌落
提取DNA 测序（（（得到了你要的哦）））
选定菌落，液氮保存本回答被提问者采纳