rnai技术的基本程序主要为

Question

如题所述

Answer 1

rnai技术的基本程序主要为：确定干扰靶点、合成siRNA、转染siRNA到细胞中。

1、确定干扰靶点：通过基因组学凳厅袜、转录组学等手段，确定需要干扰的靶基因或RNA。

2、合成siRNA：根据确定的干扰靶点，利用化学合成方法制备相应的siRNA。

3、转染siRNA到细胞中：将制备好的siRNA转染到目标细胞中，通过RNAi机制诱导靶基因mRNA的降解，从而抑制靶基因的表达。

制备至少三个靶点RNAi质粒；构建靶基因重组真核表达质粒：靶基因与报告基因融合。因为siRNA是在核酸水平起效，所以，一般我们只克隆靶基因CDS区片段。将各RNAi质粒分别与靶基因真核表达质粒瞬时共转染入工具细胞。

通过荧光显微镜检测实验组相对于阴性对照组（阴性对照siRNA+靶基因真核表达质粒）报告基因的表达水平下降程度；用报告基因抗体进行WesternBlot检测，来伏团间接反映靶基因siRNA的抑制效率。

RNAi实验常见问题：

1、目的细胞暂时不易得到，比如说原代培养的细胞，稀有难得的细胞株或者目的细胞暂时还没有到位。

2、目的细胞转染效率低（转染效率在60%以下一般都认为转染效率枣激偏低）。

3、目的细胞需要诱导才能表达靶基因。

4、尚无靶基因的抗体。