回答下列有关基因工程的问题．肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌．研究人员利
回答下列有关基因工程的问题．肺细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌．研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实现表达后，发现肺癌细胞的增殖受到抑制．该基因工程技术基本流程如图1．（1）进行过程①时，需用______酶切开载体以插入let-7基因．（2）进行过程 ②时，需用______酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于细胞培养．（3）研究发现，let-7基因能影响癌基因RAS的表达，其影响机理如图2．据图分析，可从细胞中提取______进行分子杂交，以直接检测let-7基因是否转录．肺癌细胞增殖受到抑制，可能是由于细胞中______（RASmRNA/RAS蛋白质）含量减少引起的．（4）某线性DNA分子分别用限制酶HindⅢ和SmaⅠ处理，然后用这两种酶同时处理，得到如下片段（kb为千个碱基对）：HindⅢ：2.5kb，5.0kb； SmaⅠ：2.0kb，5.5kb；HindⅢ和SmaⅠ：2.5kb，3.0kb，2.0kb；限制酶HindⅢ和SmaⅠ在此DNA分子中各有______个识别序列．两酶同时处理后得到的片段，再用限制酶EcoRⅠ处理，结果导致凝胶上3.0kb的片段消失，产生一个1.5kb的新片段．将该DNA分子内部的限制酶HindⅢ、SmaⅠ、EcoRⅠ的切割位点标注在答题纸的指定位置．______．（5）现有一长度为1000碱基对（bp）的DNA分子，用限制酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，说明此DNA分子为______（线性或环状）．用Kpn1单独酶切，得到400bp和600bp两种长度的DNA分子片段；用EcoRI、Kpnl同时酶切后得到200bp和600bp两种长度的DNA分子片段．该DNA分子的酶切图谱是______．
（2）过程②表示动物细胞培养，培养过程中出现接触抑制现象后，可以用胰蛋白酶处理，使之分散成单个细胞，随后分装到新的培养瓶中进行传代培养．
（3）判断目的基因是否在受体细胞中转录，可用分子杂交技术来检测，从细胞中提取mRNA和用放射性同位素或者荧光标记的目的基因单链DNA片段进行杂交．据图2可知，let-7基因影响RAS基因表达的机理是：let-7基因转录产物miRNA与RAS基因转录产物RAS mRNA结合，使RAS基因翻译受到抑制，引起细胞中的RAS蛋白含量减少，进而导致癌细胞增殖受到抑制．
（4）线性DNA分子在限制酶HindⅢ的切割下形成2.5kb和5.0kb的片段，因此限制酶HindⅢ在该DNA分子上具有一个酶切位点；同理可得，限制酶SmaⅠ在该DNA分子上也具有一个酶切位点．两种酶同时切割时，根据所得片段可以判断，限制酶HindⅢ的酶切位点在DNA分子左侧的2.5kb处，限制酶SmaⅠ的酶切位点在DNA分子右侧的2.0kb处，中间刚好有个3.0kb的片段．再用限制酶EcoRⅠ处理，结果导致凝胶上3.0kb的片段消失，产生一个1.5kb的新片段，说明限制酶EcoRⅠ的酶切位点就在3.0kb片段的中间位置．
（5）由于DNA分子用限制酶Eco R1酶切后得到的DNA分子仍是1000bp，说明此DNA分子为环状DNA．用Kpn1单独酶切，得到400bp和600bp两种长度的DNA分子片段，说明该酶在该DNA分子上具有两个切点；用EcoRI、Kpnl同时酶切后得到200bp和600bp两种长度的DNA分子片段，说明EcoRI的切点刚好在400bp片段的中间，由此画图即可．
故答案为：
（1）限制性核酸内切酶；
（2）胰蛋白；
（3）RNA、RAS蛋白质；
（4）一
（5）环状、
