使用Multisitegateway技术构建载体的方法 Multisite gateway 实验步骤如下 设计含有attB位点的PCR
引物建议使用Vector NTI Advance 软件来设计含有attB和attBr的引物。 上游引物必须同时满足以下条件 含有2225 bp的attB位点 至少1825 bp的模板或插入片段特异性的序列 multisitegateway引物序列的特异性 Fig specificsequences Multisitegateway 下游引物的设计也需满足以上三个条件。 因为我们要在E coli 体内表达蛋白 所以设计上游引物时 要在attB位点之前加上SD Shine Dalgarno 序列来保证翻译的准确性。同时为了保证阅读框的正确性 需要在attB位点之前加上两个
核苷酸 但不能是AA AG和GA 因为它们会和attB位点末端的
胸腺嘧啶核苷酸T形成
终止密码子。 得到PCR产物并电泳检测PCR程序设置和电泳方法同上 需要指出的是 若PCR的模板是包含卡那抗性基因 kanamycin resistance gene 的质粒 需要在电泳检测和纯化PCR产物前对其进行消化 使用的酶是Dpn 作用是为了去除模板对后续反应的干扰。 消化的体系和过程 在50μl的PCR反应体系中 加入5 μl10X REact Dpn37 孵育15 min 65 热激15 min使Dpn BP反应得到entryclone 反应体系如下 BP反应的引物组分Table BPreaction Components Sample Negative control positive control attB PCR product 20 50 fmoles pDONRTMvector 150 ng pMSGW control plasmid 100 ng TEBuffer pH 其中携带attB位点的PCR产物的量可以用以下公式来计算 50 fmoles 2500 bp 660 fg fmoles ng106fg 82 PCRproduct required 实验步骤如下 按上面计算方法和反应体系加入合适体积的pDONRTMvector 和PCR产物 20冰箱里拿出BP Clonase II enzyme mix 放在冰盒上两分钟左右使其解冻。 轻轻涡旋BP酶两次每次两秒钟 BPClonaseII enzyme mix 并立即将其送回 20 冰箱里 样品轻轻涡旋几次使其混合均匀。 25孵育1 蛋白酶K37 孵育10 min。 之后进入转化环节后续实验流程同经典载体构建 最终得到含有attL位点的entry clone。 LR反应组分Table LRreaction Component Sample Negative Control attL4 attR1entry clone 10 fmoles attL2entry clone 10 fmoles attR2 attL3entry clone 10 fmoles pDEST R4 R3 Vector II 20 fmoles TEBuffer pH 使用Infusion方法快速大量构建载体的方法 fusion是一种不依赖于限制性内切酶Restriction Free 的克隆方法 引入此方法的最初动机是为了在一个载体的任意位置引入外源DNA片段。此方法基于DNA片度的扩增
得到的大量的DNA可以作为线性载体扩增的模板。这个方法可实现将多个不同的外源基因同时插入某一个特定的载体的任意我们感兴趣的位置 从而弥补了位点特异性重组系统中对特异位点和特殊系统的需求 为分子克隆和蛋白表达的调控提供广阔的思路和方法。这种方法的原理是DNA片段之间的
同源重组 现在应用比较广泛的是由Clontech公司提供的In FusionTM system
它可以实现以下克隆需求 同时克隆多个DNA片段 Simultaneous cloning 基因的替换 Gene replacement 多位点突变 Multisite mutagenesis 多组分重组 Multi componentassembly 同时插入和删除基因 Simultaneous insertionand deletion 引物设计及目的基因片段扩增该方法的原理和步骤同前in fusion PCR 只是这个方法中PCR产物需用Dpn 将模板消化。
载体线性化载体线性化的方法既可以用特异性酶切消化也可以通过常规PCR 使用PCR的方式使载体线性化消除了对特异性酶切位点的依赖和限制 同时彻底实现载体和片段之间的无缝连接 消除后续由于特殊碱基序列的加入对实验结果的影响 同时大华 35大节省了时间和成本投入。
fusion“连接”反应将纯化的DNA片段和载体按照2 1的摩尔比混合入250 EP管中必要时可以加入In fusionTM enzyme 由Clontech提供 和相应buffer 是反应总体系为10 μl。之后共同转入感受态细胞 进入筛选环节。 感受态细胞的制备在线虫载体构建的整个过程中 最重要的实验材料是各种促进反应进行的酶和高转化效率的感受态细胞。不同的载体因其携带筛选基因或者特异表达的宿主的不同 需要诸如DH5α、TOP10等不同类型的感受态细胞 例如在Multisite gateway反应中 通常需要借助ccdB的筛选机制 这种情况下就不能使用携带有ccdA基因的菌株 如TOP10F’ 。
所以 在不同方法的构建中 要严格选择感受态细胞类型。以下以实验室常用的感受态细胞DH5α为例 详述用
氯化钙 CaCl2 法的制备过程。 用CaCl2法制备感受态细胞的原理是通过低渗的CaCl2溶液在低温 时处理快速生长的细菌从而得到感受态菌株细菌外形膨胀为球形 这样的形态结构有利于外源
DNA分子形成抗DNA酶的羟基 钙磷酸复合物 这种复合物会粘附在细菌表面 如果热激 细胞对DNA的吸收将大大加强。 实验的关键是选取出于对数生长期的菌株 所有的操作必须尽可能保持在完全无污染无杂菌并且低温的条件下进行。
实验材料及准备事项 100ml 胰化蛋白胨 CaCl2的制备称取22 CaCl2溶于200ml事先灭菌的水中 充分溶解后保存于4 冰箱中。
将浓度为100的
甘油120 高温灭菌。 器材10 ml移液管 需灭菌玻璃大培养皿 内铺一张滤纸 需灭菌大、中、小枪头各一盒 需灭菌 50 ml离心管 mlEP管 用铁饭盒灭菌 100 ml SOB培养基需40个EP管 步骤如下 80冰箱里取出DH5α 常温使其冻融后通过接种环接种细菌与无抗培养皿中。将培养板放入3 将预先水浴锅灭菌的15ml离心管放在超净
台中 紫外照射半个小时以上。从培养皿上挑取单个菌落 接种至离心管中 导入3 ml无抗培养基LB 37 摇床振荡过夜培养 转速为300 rpm 。次日取1 ml菌液接种至100 ml
LB培养基中 以215 rpm的转速37 培养2 3小时。期间 要每隔半个小时测定一下600 nm的
OD值。 停止培养将烧瓶置于冰上10 15分钟 同时将预先灭好菌的50 ml离心管也置于冰上冷却至0 在超净台中将菌液尽可能平均的分装入两个50 ml离心管中 以4000 rmp的转速离心10分钟。 弃上清将离心管倒置在滤纸上1分钟 以吸干残留的培养基。每个离心管中加入5 ml预冷的浓度为0 1M的CaCl2溶液 重悬菌体 并开始计时 可以用
移液枪轻轻反复吹打30分钟。 将悬浮好的菌液再次以4000rmp的转速离心5分钟 去掉上清 吸干残余培养基后 每管加入2 ml预冷的浓度为0 M的CaCl2溶液反复吹打以重悬菌体 此时可以将两个离心管合为一个 放于冰上预冷20分钟 这期间 可以将已灭菌的1 mlEP管放于冰上预冷。 加入500 μl浓度为100 的甘油 mlEP管中。等全部分装
完成时 投于液氮中1个小时 之后再转移到 80 冰箱中。 细菌转化效率的检测方法 设置阳性对照和阴性对照 阳性对照是为了估算细菌的转化效率 阴性对照是排除感受态细胞被污染的可能 及查明失败的可能因素。 阴性对照 只将感受态细胞涂于含某种抗性的平板上 而不加入任何DNA 正常情况下不应该有单菌落出现。 阳性对照 选择标准质粒 一般是pUC19 以50 pg、100 pg的量分别转化到感受态细胞里 将平板放于37 培养箱里过夜培养。数单菌落的个数以估计感受态的转化效率。
效率估算公式为
转化率 1000克隆 10pg DNA 当此值达到1 106时 可满足一般克隆的实验需求 当此值达到1 107时 可用作更复杂克隆的构建需求。 线虫的显微注射通过将外源基因显微注射到
雌雄同体的线虫的性腺 gonad 能够获得有种系特异性的线虫。DNA片段可以通过染色体之间的同源和非同源的整合被传递到下一代中。显微注射的步骤如下 制作Pad将配置好的2 的琼脂糖放在水浴锅内防止其凝固。吸取100 μl于干净的载玻片上 并迅速将另一块载玻片轻压上面 待琼脂糖稍微干燥时取走载玻片 标记Pad的正反面之后放于干燥箱 80 中过夜。
拉制电极常常用含有内芯的硼硅玻璃微电极作为注射用电极 该电极的外径为1 nm内径0 75 nm。用拉制仪拉制好的电极尖端是封闭的 在用之前需要打开一个开口 开口的大小要适宜。
准备注射液注射液的体系一般选取10 目的载体质粒的浓度范围为110 μl。其余体积用1TE补平。以12 000 rpm转速离心3分钟。 吸取1μl注射液到拉好的电极中 放置1520分钟 目的是为了使注射液通过内芯的
虹吸作用流入电极尖端 并排除内气泡。 拿出注射要用的Pad在上面滴一滴油 保证有足够的油使线虫减慢干燥的过程 但不能太多以使其移动。 用一个干净的针needle 触碰到油上面 挑取N2时期的成虫 线虫挑取的区域应该远离菌斑所在位置 以避免将菌落带到pad上面。选择有容易辨别的gonad的线虫也同样重要。将线虫垂直放在pad上 使其gonad位于左侧 通常 线虫的阴部 vulva 会指向与needle的方向 两侧的gonad会直接与体壁对应。 当needle恰好位于载玻片上时将线虫聚焦在10 的物镜下 确定看到线虫的gonad。将线虫以和needle成15 到45 的角度摆放 通过轻轻降低needle使其和线虫出于同一水平。转换到40 物镜 聚焦到胞体的gonad 使用调试器上下移动needle 直到针尖对准胞体的gonad。 轻轻沿着needle移动线虫当needle插入线虫体内时 按照gonad和虫体壁处于相反位置的方式轻轻压线虫。轻旋调节器 knob 开始DNA注射液的流入 快速的开合 如果needle确定位于gonad处 此处部位会膨胀并充满液体。如果液体流动不畅 轻轻触碰桌面有助于解决此问题。要避免因加入液体过多导致液体沿着needle进入部位流散到线虫的其他部位。 将needle从线虫中拿出建议沿着逆时针方向。回到10 物镜下 滴一滴M9 buffer使线虫悬浮。使用眉毛挑将线虫放置于另外一个含有M9 buffer的板子上。这样做的目的是为了洗掉多余的油。再将线虫挑到含有细菌的板子上。一个板子上可以放置多条注射后的线虫。
两三天后 数F1转基因线虫 并将折射成功的线虫单独转移到板子上以得到有稳定转基因种系的线虫。 显微注射线虫的gonadFig elegansgonad 3910 可能出现的问题及策略 注射后线虫破裂或者死掉的原因可能是needle太大了 或者线虫缺水死亡 方法可能是每注射一个线虫的gonad就换一个新的needle 如果线虫没有直立 原因可能是pad太薄或者需要没烘干 可以通过将板子放在罩子上几个小时来烘干 如果线虫干的太快 可以使用更薄的pad或者在注射前将线虫转移到较湿的板子上。 实验结果与讨论实验中用到的质粒的构建方法 在前言部分和方法部门已做了详细阐述 需要研究的相关基因的启动子的信息 诸如启动子大小 表达部位等 借助于相关文献的报道 在Wormbase中截取特定长度的DNA序列 在NCBI中查找此基因的上下游序列和基因方向 借助网页UCSC提供的序列信息最终得到启动子序列。但在设计启动子引物时 必须留意到序列中3’端和5’端的序列可以根据引物的匹配性在小范围内适当调整。还有一些神经元的位置因为缺乏确切表达谱的启动子而无法最终确定。
线虫有302个神经元 标记这些神经元需要大量的质粒构建。在实验初期 我们通过传统酶切连接方法和改造的常用线虫载体组成的BP反应来实现。但随着课题的发展和方法的改进 我们发现Multisite gateway方法更为便捷和高效 特别是在购买了雌雄同体线虫启动子库后 这种技术不仅被用来标记线虫神经元 更多的用在rescue实验和钙信号的测定的构建中。同时 为了使整个课题有一套完整的体系 我们又花费大量的精力将之前不太标准的由gateway反应得到的构建进行了改造 得到一个可以通用的表达体系。 改造Multisitegateway 中的载体pDESTR4 R3为pPD49 26 R4 R3 在使用Multisite gateway 技术构建多克隆载体的过程中 我们发现 这个系统并不是完美的
因为这个系统中各个重组位点的序列有一定的相似性 所以如果想要插入载体的片段的序列 特别是与引物匹配的那一段 与重组位点有相似性时 可能会导致这个技术中所涵盖的反应失败。同时 当我们想用一个启动子驱动不止两个以上基因的表达时 不能直接只用Invitrogen公司提供的试剂盒中的pDESTR4R3 因为外源基因在线虫体内表达时 需要3’UTR稳定整个翻译过程中的顺利进行 但该公司试剂盒提供的载体中不含我们需要的3’UTR 因此 我们改造了一个新的LR反应的载体pPD49 26 R4R3 因为pPD49 26中含带unc54 3’UTR 而且实验证华 41明我们改造的载体同样有很高的反应效率 1在Multisitegateway反应中验证pPD49 26 R4 R3的有效性 Pgpa 4特异性标记ASI神经元 可以驱动TagRFP t在此神经元中表达。 为明场与荧光共定位的图。Fig pPD4926 R4 R3 LRreaction multisitegateway ASI can 改造attL1Promoter attL2为attL4 promoter attR1 验证adaptor clone 如前所述 我们将携带attB1 attB2位点的启动子进行改造得到了标准Multisite gateway反应中的第一个entry clone 在这个改造的过程中 需要引入一个中间反应物 adaptor clone。如果我们可以观察到改造后的启动子能够驱动荧光蛋白在特定部位表达 由此可以验证adaptor clone的有效性。在本课题中 我们使用改造后的启动子Pdaf 7驱动荧光蛋白在神经元ASI里表达 由此adaptor clone的有效性得到验证。