高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价
请在实验前预习《基础分析化学实验（第二版）》137－140页。
【目的】
(1) 了解高效液相色谱仪的工作原理；
(2) 学习评价液相色谱反相柱的方法。
【原理】
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。
评价色谱柱的性能参数主要有：
（1）
柱效（理论塔板数）n
式中tr为测试物的保留时间，W1/2为色谱峰的半峰宽。
（2）
容量因子k’
式中t0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。
(3)
相对保留值（选择因子）α
式中k1’和k2’分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。
(4)
分离度Rs
式中tr1、tr2分别为相邻两峰的保留时间，Wb1、Wb2分别为两峰的底宽。对于高斯峰来讲，Wb=1.70W1/2。
为达到好的分离，我们希望n、α和Rs值尽可能大。一般的分离（如α=1.2，Rs=1.5），需n达到2000。柱压一般为104 kPa 或更小一些。本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。
【仪器和试剂】
Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i进样器，440检测器和记录仪组成）
色谱柱：5 cm×4.6 mm I.D., YWG-C18H37 (ODS)，10 μm
流动相：甲醇－水(80+20)
样品I： 含尿嘧啶 (0.010 mg·mL－1)、萘 (0.010 mg·mL－1)、联苯 (0.010 mg·mL－1)、菲（0.006 mg·mL－1）的甲醇混合溶液；
样品I I：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液。溶液浓度约为0.01mg·mL－1；
【实验内容】
（1）准备流动相。将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL溶液，混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中。
（2）检查电路连接和液路连接正确以后，接通高压泵、检测器和记录仪的电源。设定操作条件为：流速1.0 mL·min－1，压力上限2�0�7104 kPa (约3000 psi)，检测波长254 nm（该仪器检测波长已固定），灵敏度0.2 AUFS，记录仪走纸速度1.0 cm·min－1，记录灵敏度为5 mV。开启记录仪走纸开关记录基线。并调节基线到合适位置（一般为距右10%处）。
（3）待基线平稳后（建议观察检测器的读数显示），将进样阀手柄拨到“Load”的位置，使用专用的液相色谱微量注射器取5μL样品注入色谱仪进样口，然后将手柄拨到“Inject”位置，同时按一下检测器的标记按钮，同时计时，记录色谱图。
（4）重复（3）的实验两次。
（5）用同样方法进纯样品的甲醇溶液，确定出峰顺序。
（6）根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽，然后计算色谱柱参数n、k’，以及相邻两峰的α、Rs
（7）将流速降为0，待压力降为0后关机。
思考题
1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点？
2. 如何保护色谱柱延长使用寿命？
高效液相色谱实验II
固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量
【目的】
（1）学习固相萃取法处理样品；
（2）用内标法定量。
【原理】
固相萃取法是色谱法的一个重要的应用。在此方法中，使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱，样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后，用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来，定容成小体积被测样品溶液。使用固相萃取法，可以使样品中的组分得到浓缩，同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分，从而提高了分析的灵敏度。固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理，而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理。C18固相萃取小柱具有疏水作用，对非极性的组分有吸附作用，因此可以从水中将多核芳烃萃取出来，完成浓缩样品的作用。固相萃取小柱还有其他类型，如极性、离子交换等。
内标法的原理是，设在V mL样品中含有Wi g待测组分i，加入WS g内标物S，混匀后进样，得组分i及内标物S的峰面积分别为Ai及AS。由于峰面积正比于通过检测器的物质量，所以有：
Wi=fi Ai
WS =fS AS
式中fi、fS分别为组分i和内标S的校正因子。
两式相除，得
所以，组分i的体积浓度为：
fi’可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到。内标法是一种相对测量方法，因此，进样量不必准确，操作条件稍有变化对结果没有什么影响。
【仪器和试剂】
Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成）
色谱柱：5 cm×4.6 mm I.D., YWG-C18H37 (ODS)，10 μm
流动相：甲醇－水(80+20) 流速：1.0 mL·min－1
检测波长：254 nm
C18固相萃取小柱：2支
25 mL移液管：1支
50 mL医用注射器：1支
10 mL医用注射器：2支
2 mL容量瓶：2个
样品I：内标标准样，含萘(0.010 mg·mL－1)、联苯(0.010 mg·mL－1)、
菲（0.006 mg·mL－1）的甲醇溶液。
样品II：内标物溶液。含联苯（0.10 mg·mL－1）的甲醇溶液。
样品III：含萘、菲的被测水样。
【实验内容】
（1）固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱，再将2 mL纯水压过小柱。
（2）用移液管取25 mL水样，用50 mL注射器压过小柱，这时水样中的萘和菲被吸附在小柱上。在小柱下端承接一2 mL的容量瓶，将约1.5 mL甲醇用10 mL注射器压过小柱到容量瓶中，加入一定量内标联苯溶液，定容摇匀，得到浓缩的样品。
（3）按“实验I”中的步骤，进样分析内标标准样和浓缩样品各三次。
（4）取平均结果，计算峰面积As和Ai；根据内标标准样的浓度计算fi’，再计算出浓缩样品中的萘和菲的浓度，进而计算出原水样中的浓度（mg·mL－1）。
思考题
1. 内标法与外标法各有哪些特点？ 本实验为什么采用内标法为好？
为什么要对色谱分析中的样品进行预处理？简单列出三个以上的原因。
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