BLAST设计引物的问题?

各位好,原来用Primer5.0设计引物,但是效果一直都不好,怀疑特异性不强,现在改用BLAST设计引物:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/,但是在这一步,,
我不知道如何选择参数,我是做果树的,但是我们实验室有人做病毒,我现在怀疑有DNA污染,我的问题是,如何设置参数,才能达到以下俩个目的:1、对我的基因克隆达到最好的效果,2、避免克隆到其他的DNA,尤其是这个病毒的污染,谢谢了,如果在用blast设计引物有心得的话,请一并告诉,小弟在此感谢!

这个参数其实是选定物种,你可以尝试在第一次设计的时候,只添加你做的果树的物种的拉丁名去检索。
获得理想的序列以后,用病毒的基因组去blast,确认你的引物序列在里面没有,或很少有同源序列就好了。
如果确认你的样品中有这个序列,引物用primer设计过没有问题,最好能够查看一下:
1.样品制备的问题,是否能够再次纯化模板DNA,或者是稀释模板,减少样品中的干扰成分
2.选择热启动DNA聚合酶,减少非特异扩增(或者选择商品化的Mix,Mix都经过优化的,扩增能力比普通Taq酶,或者是高保真酶要强)
3.用梯度PCR的方式,摸索最佳的退火温度,减少非特异扩增
4.如果确实有其他外源DNA的污染,最好把水,引物,酶全部都换新的再试,因为一旦出现污染,哪怕只是一点点,也会对结果有很大干扰的。追问

谢谢您了,您的回答基本满足了我的问题,我们现在测序结果回来最多的是荧光假单胞杆菌,好几个人做完后,测序结果都是这个的,
对于,你回答的第三点,我有些疑问,我做了梯度PCR,温度从55-65,条带都一样,很多很杂,但是没有什么明显的区别,是不是引物特异性不够强,还是这么回事

追答

通常出现多的条带,是由于引物特异性的问题带来的,但是如果样品中有污染的话,就不好说了。所以引物设计好后,可以在有可能污染的物种中blast一下,看看什么情况,如果没有同源序列的话,就在自己物种的基因组中blast,看是什么位置引起了非特异结合,考虑更换引物的位置。
但是,如果样品中有污染,基本上梯度PCR就没有什么用了。因为如果条带一样很多,需要看一下,不加引物的对照,或者换一个模板的对照,能给出什么结果。如果不加引物或者其他模板,结果一样,还是赶紧调整体系。

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