BLAST设计引物的问题？

Question

各位好，原来用Primer5.0设计引物，但是效果一直都不好，怀疑特异性不强，现在改用BLAST设计引物：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，但是在这一步，，
我不知道如何选择参数，我是做果树的，但是我们实验室有人做病毒，我现在怀疑有DNA污染，我的问题是，如何设置参数，才能达到以下俩个目的：1、对我的基因克隆达到最好的效果，2、避免克隆到其他的DNA，尤其是这个病毒的污染，谢谢了，如果在用blast设计引物有心得的话，请一并告诉，小弟在此感谢！

Answer 1

这个参数其实是选定物种，你可以尝试在第一次设计的时候，只添加你做的果树的物种的拉丁名去检索。
获得理想的序列以后，用病毒的基因组去blast，确认你的引物序列在里面没有，或很少有同源序列就好了。
如果确认你的样品中有这个序列，引物用primer设计过没有问题，最好能够查看一下：
1.样品制备的问题，是否能够再次纯化模板DNA，或者是稀释模板，减少样品中的干扰成分
2.选择热启动DNA聚合酶，减少非特异扩增（或者选择商品化的Mix，Mix都经过优化的，扩增能力比普通Taq酶，或者是高保真酶要强）
3.用梯度PCR的方式，摸索最佳的退火温度，减少非特异扩增
4.如果确实有其他外源DNA的污染，最好把水，引物，酶全部都换新的再试，因为一旦出现污染，哪怕只是一点点，也会对结果有很大干扰的。追问

谢谢您了，您的回答基本满足了我的问题，我们现在测序结果回来最多的是荧光假单胞杆菌，好几个人做完后，测序结果都是这个的，
对于，你回答的第三点，我有些疑问，我做了梯度PCR，温度从55-65，条带都一样，很多很杂，但是没有什么明显的区别，是不是引物特异性不够强，还是这么回事

追答

通常出现多的条带，是由于引物特异性的问题带来的，但是如果样品中有污染的话，就不好说了。所以引物设计好后，可以在有可能污染的物种中blast一下，看看什么情况，如果没有同源序列的话，就在自己物种的基因组中blast，看是什么位置引起了非特异结合，考虑更换引物的位置。
但是，如果样品中有污染，基本上梯度PCR就没有什么用了。因为如果条带一样很多，需要看一下，不加引物的对照，或者换一个模板的对照，能给出什么结果。如果不加引物或者其他模板，结果一样，还是赶紧调整体系。