第1个回答 2022-07-11
RNA介绍
核糖核酸(缩写为RNA,即Ribonucleic
Acid),存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和碱基构成。RNA的碱基主要有4种,即A(腺嘌呤)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)、U(尿嘧啶),其中,U(尿嘧啶)取代了DN的T(胸腺嘧啶)。核糖核酸在体内的作用主要是引导蛋白质的合成。
RNA提取(TRlzol提取法)
1.取样,研磨(组织): 迅速取出组织样本,在电子天平中称重约0.3-0.5 g(也可根据实际经验估测取样量),放入液氮预冷的研钵中,边研磨边加液氮,整个过程都不要使组织融化。
2.裂解:
(1)组织:按每100
mg组织加入1 mL TRIzol,继续研磨至较细粉末,将组织裂解液转移到1.5 mL 离心管中,每管约1 mL,室温放置15min以上;也可直接将研磨的较细粉末用枪头刮入已取好的含有1 mL TRIzol的1.5 mL 离心管中,4℃放置10 min,或室温放置15min以上;
(2)细胞:(悬浮细胞需预处理:4℃,3000
rpm,离心10 min,收集细胞沉淀于1.5 mL 离心管底);弃去培养液,加入适量1xPBS洗一次,弃去1xPBS,加入1 mL
TRIzol试剂(TRIzol加入量基于细胞数(1 mL/ 0.5-1x107个)或培养瓶的面积(1 mL/10 cm2),用移液器轻吹打几次,超净台中室温放置15 min以上,转移1 mL 液体到1.5 mL 离心管中。
(3)若不马上进行提取,可放入-80℃冰箱中冻存。
3.抽提: 按0.2 mL 氯仿/ 1 mL TRIzol的比例加入氯仿,vortex 30 sec或用手剧烈摇动15 sec,室温放置2-3 min后, 4℃,12000 rpm,离心15 min;小心转移上清到一新的1.5 mL 离心管中,不要吸取中间层。
4.沉淀: 按异丙醇/上清=1:1的比例加入异丙醇,上下颠倒混匀,-20℃放置30 min后,4℃,12000 rpm 离心15 min。弃上清,异丙醇不要回流过多,可再短暂离心,用移液器将剩余的异丙醇吸出。
5.漂洗: 加入1 mL 75%乙醇,用手指将沉淀块弹起,上下颠倒几次,4℃,12000 rpm 离心5 min。弃上清,75%乙醇不要回流过多,可再短暂离心,用移液器将剩余的75%乙醇吸出。
6. 风干,溶解: 超净台中自然干燥 5-10 min,不要真空离心干燥, RNA不要完全干透,以防不能完全溶解;用DEPC水溶解RNA,60-65℃助溶 5-10 min。
7. 定量: 进行Total RNA定量,如果不马上定量,将样品贮存于-80℃。
RNA定量
我们一般通过Nanodrop紫外分光光度计测定RNA样本在260nm处的吸光值来计算RNA含量。但是,DNA和RNA都有吸收紫外光的性质,其性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。所以紫外法不能区分DNA和RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量。
Nanodrop紫外分光光度计可以得到以下参数:
OD230 :杂质(酚、糖原等碳水化合物)的吸光度;
OD260 :核酸的吸光度;
OD280 :蛋白质的吸光度;
OD260 /280 :纯的RNA比值在1.5 ~2.1之间,如果比值低,表示受到蛋白质的污染;
OD260 /230 :纯的RNA比值在2.0 ~2.5之间,如果比值低,表示受到有机物如糖、肽、苯酚等的污染。
RNA完整性鉴定
我们一般使用电泳、Agilent2100等仪器来鉴定RNA的完整
RIN值
RIN(RNA integrity number)代表RNA完整性的数值,对total RNA的完整性进行数字化的评估,范围在1 ~10,数值越接近10表明样品完整性越高,反之完整性越差,如下图所示。
RNA降解程度对各个测序项目的影响
① 转录组测序: 降解程度会影响5’ 端的数据质量;
② micRNA测序: 由于本身的片段较小,受降解的影响较小;
③ 降解组测序: 若受到外源降解,回复给内源性降解,受影响较大;
④ lncRNA和circRNA测序: rRNA去除方式建库,样本降解影响小。
原核污染对各个测序项目的影响
① 转录组测序: 一般不影响数据,轻微污染时可无视,污染较严重时需增加建库起始量;
②micRNA测序: 对数据影响较小,一般是按污染比例对数据的比对率和有效数据量产生影响,轻微污染时可无视,污染比例较高时需加测数据量;
③ 降解组: 情况同转录组;
④ lncRNA和circRNA测序: 影响极大,建库方式决定了如果污染,若不给予处理,数据可能完全没法用,故对该问题需要高度警戒。
常见问题分析
得率低:
① 样品裂解或匀浆处理不彻底;
② RNA沉淀未完全溶解。
A260/A280<1.65(RIN<7):
①检测吸光度时,RNA样品没有溶于水,而溶于了TE。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高;
②样品匀浆时加的试剂量太少;
③ 匀浆样品时未在室温放置5分钟;
④ 吸取水相时混入了有机相;
⑤ RNA沉淀未完全溶解。
RNA降解:
①组织取出后没有马上处理或冷冻;
②待提取RNA的样品保存在了-5至-20℃;
③细胞在用胰酶处理时过度;
④溶液或离心管未经RNase去除处理;
⑤电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。
DNA污染:
①样品匀浆时加的试剂量太少;
②样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等),强缓冲液或碱性溶液蛋白聚糖和多糖污染:沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染,步骤7中,每使用1mlTRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2MNaCl)混合离心,按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心,并加上以上操作步骤。
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