毛泽东最担心的是皖南的情况，一再致电项英，催促北移，并在12月26日再次对项英提出了尖锐的批评。
与此同时，毛泽东为新四军军部的安全转移做着最后的努力。12月27日，毛泽东一面请周恩来继续向蒋介石交涉，要他命令李品仙不得妨碍新四军北移；一面以朱德、叶挺的名义急电国民党第五战区司令长官李宗仁和副长官李品仙，恳请他们从抗战的利益出发，不要妨碍新四军的北移。
但是，这时的形势已难以逆转。顾祝同根据蒋介石将皖南新四军“一网打尽，生擒叶项”的命令，已完成围歼皖南新四军的准备，震惊中外的皖南事变终于爆发了。
1941年1月4日，新四军军部及直属部队9000余人遵令北移。由于项英的犹豫不决，行期一再延误，国民党已在新四军行进的必经地区埋下重兵。6日，仓促行动的部队到达泾县茂林地区时，突然受到国民党第33集团军总司令上官云相指挥的7个师8万余人的严密包围和猛烈袭击。双方兵力悬殊，国民党军队又已作了充分准备，新四军陷入苦战中。
7天7夜后，新四军终于因弹尽粮绝而全军覆没。奉命同国民党军队谈判的军长叶挺被扣；项英、袁国平、周子昆等遇难。1月15日，中共中央召开政治局会议，检讨新四军失败的原因，毛泽东指出：从我们自己方面来说，首先是由于项英、袁国平等没有反磨擦的思想准备，其次是指挥上的错误。他提出：袁、项的错误须立即宣布，如何处置交七大解决。会议通过了毛泽东起草的《中央关于项袁错误的决定》。在这次会上毛泽东提出：我们要实行全国的政治反攻，必须要像我们前次反对第一次反共高潮时一样有非常强硬的态度，只有不怕决裂，才能打退国民党的进攻。他又说：左派主张我们马上与国民党大打起来，我们也不能实行这种政策。
1月17日，蒋介石发布取消新四军的命令，把叶挺交付军事法庭审判，将反共高潮推到顶点。国共关系已处于异常紧张的状态。这时，毛泽东反而更加冷静。他接受了刘少奇的建议，提出“在政治上取猛烈攻势，而在军事上暂时还只能取守势”。
1月20日，中共中央召开政治局会议，讨论对付时局的办法。毛泽东指出，要挽救时局，实现好转，必须由国民党当局取消1月17日的命令。会议决定：成立中央军委主席团，由毛泽东、朱德、彭德怀、周恩来、王稼祥组成，军委实际工作由主席团办理。驻国民党统治区的各办事处实行撤退。
当天，根据政治局会议决定，在延安发布了毛泽东为中共中央革命军事委员会起草的重建新四军军部的命令，任命陈毅为新四军代理军长，张云逸为副军长，刘少奇为政治委员，赖传珠为参谋长，邓子恢为政治部主任。随后，新四军军部在苏北盐城成立，整编全军为7个师和7个独立旅，共9万多人，在大江南北坚持敌后抗战。
同时，也根据政治局会议的决定，毛泽东以中共中央革命军事委员会发言人的身分对新华社记者发表关于皖南事变的谈话。他指出：“此次皖南反共事变，酝酿已久。目前的发展，不过是全国性突然事变的开端而已。”“特别是1月17日的命令，包含着严重的政治意义。因为发令者敢于公开发此反革命命令，冒天下之大不韪，必已具有全面破裂和彻底投降的决心。”他说：“目前全国人民的紧急任务，在于以最大的警惕性，注视事变的发展，准备着对付任何黑暗的反动局面，绝对不能粗心大意。”
毛泽东的这个谈话，引起重大反响，不仅“全党一致拥护，情绪异常兴奋”，而且深受党外人士的好评。国民党爱国民主人士宋庆龄、何香凝、柳亚子、彭泽民、陈友仁等联名致信蒋介石，谴责政府当局对新四军的迫害，要求释放叶挺；从前怕共产党过于强硬会引起破裂的民族资产阶级代表陈嘉庚、张一鹿等仗义执言；冯玉祥、于右任、孙科等也对蒋介石表示不满，冯玉祥说：“只有共产党的十二条，国事才能解决。”这件事，在国际上也引起广泛重视。斯特朗、斯诺等在美国报纸上发表报道和评论，向世界披露皖南事变的真相。英、美、苏等国都不支持蒋介石的作法，对他形成很大压力。
蒋介石突然发现自己陷入了内外交困、空前孤立的狼狈境地，这是他根本没有料想到的。更加出乎他意外的是，连日本军队也没有因为他发动反共内战而停止进攻。1月下旬，日军发动豫南战役，将国民党军队15万人包围在平汉铁路以东，两军发生激战。
这时，国内政治斗争的焦点已转到中共方面的参政员是否出席第二届国民参政会的问题上。第二届国民参政会参政员的名单是在皖南事变前夕公布的。中共方面的参政员仍是毛泽东、董必武、邓颖超等7人。由于皖南事变的发生，各民主党派希望通过这个会议来缓解一下国共矛盾，纷纷表示这次会议中共方面的代表必不可少。美国总统罗斯福的代表居里也表示：留在重庆，专等观光国民参政会。这给蒋介石造成很大压力，为了摆脱困境，必须争取中共方面的参政员出席会议。
毛泽东同周恩来电报往来，反复协商，认为中共代表不能无条件出席。
经过这场斗争，蒋介石在参政会的讲话中虽然继续攻击中共，但不得不宣称：“以后亦决无‘剿共’的军事，这是本人可负责声明而向贵会保证的”。毛泽东评论蒋介石的这个讲话是“一种阿Q主义，骂我一顿，他有面子，却借此收兵”。它实际上标志着蒋介石发动的这次规模更大的反共高潮又被击退了。这以后，国共关系又逐渐走向一定程度的缓和。
毛泽东在打退这次反共高潮中制订的一系列方针政策以及取得的重要历史经验，是他思想发展中的一个高峰。正如胡乔木所说：“经过打退第二次反共高潮，我们党内更团结了，毛主席的领导威信大大提高了。这半年的斗争，对后来抗战、解放战争初期的胜利都有很大的意义。”