SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)
试剂
1、电泳缓冲液(5×Tris-Glycine Buffer):Tris 15.1g,Glycine 94g,SDS 5.0g,用800ml水进行溶解,定容至1L,室温保存。
2、30%丙烯酰胺:丙烯酰胺29g,N,N’-亚甲双丙烯酰胺1g,用60ml水于37℃水浴溶解,定容至100ml,滤纸过滤,置棕色瓶室温保存。
3、1.5mol/L Tris(pH8.8):Tris碱18.165g,用80ml水进行溶解,待溶液冷却至室温,用浓HCl调pH至8.8,定容至100ml,室温保存。
4、1.0mol/L Tris(pH6.8):Tris碱12.11g,用80ml水进行溶解,待溶液冷却至室温,用浓HCl调pH至6.8,定容至100ml,室温保存。
5、10%SDS(pH7.2):SDS 100g,用900ml水进行溶解(加热至68℃可助溶),用浓HCl调pH至7.2,定容至1L,室温保存。
6、10%过硫酸铵:过硫酸铵0.1g,用1ml水进行溶解,4℃保存两周,常现配现用。
7、5×SDS凝胶加样缓冲液:1MTris-HCl(pH6.8)1.25ml,SDS 0.5g,BPB 25mg,甘油2.5ml,用水溶解后定容至5ml,室温保存。
8、染色液:甲醇:水(1:1,v/v)90ml,冰乙酸10ml,考马斯亮蓝R250 0.25g,滤纸过滤。
9、脱色液:即不加染料的染色液。
SDS-PAGE的有效分离范围 丙烯酰胺浓度(%) 线性分离范围(kD) 15 12~43 10 16~68 7.5 36~94 5.0 57~212 制胶:薄胶需分离胶约4ml、积层胶约2ml,厚胶需分离胶约6ml、积层胶约3ml。 15%分离胶 5ml 10ml 15ml 水 1.1 2.3 3.4 30%丙烯酰胺 2.5 5.0 7.5 1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 10%SDS 0.05 0.1 0.15 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 TEMED 0.002 0.004 0.006 12%分离胶 5ml 10ml 15ml 水 1.6 3.3 4.9 30%丙烯酰胺 2.0 4.0 6.0 1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 10%SDS 0.05 0.1 0.15 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 TEMED 0.002 0.004 0.006 10%分离胶 5ml 10ml 15ml 水 1.9 4.0 5.9 30%丙烯酰胺 1.7 3.3 5.0 1.5mol/L Tris(pH8.8) 1.3 2.5 3.8 10%SDS 0.05 0.1 0.15 10%过硫酸铵 0.05 0.1 0.15 TEMED 0.002 0.004 0.006 5%积层胶 2ml 3ml 5ml 水 1.4 2.1 3.4 30%丙烯酰胺 0.33 0.5 0.83 1.0mol/L Tris(pH6.8) 0.25 0.38 0.63 10%SDS 0.02 0.03 0.05 10%过硫酸铵 0.02 0.03 0.05 TEMED 0.002 0.003 0.005 上样:一般取样10μl。
1、菌液(以大肠杆菌为例):取1ml菌液,8000rpm离心3min收集菌体,生理盐水洗涤2次,加蒸馏水50μl,加2×上样液50μl,吹打混匀,沸水浴10min,瞬时离心。
2、蛋白溶液:取蛋白溶液10μl,加2×上样液10μl,沸水浴5min,瞬时离心。
电泳:先60V电泳10~20min至样品泳至积层胶和分离胶的分界处,然后110~120V电泳至样品泳到凝胶末端。
染色与脱色:将凝胶浸泡在至少5倍体积染色液,沸水浴10min染色,然后将凝胶转移至脱色液,平缓摇动4~8小时。此外,也可将凝胶直接浸泡在预冷的0.25MKCl中轻轻振摇,染色10~20min可见白色条带。
保存凝胶:脱色后的凝胶可浸于水中,长期封装在塑料袋内,注意不应将凝胶保存于脱色液,否则染色的蛋白带会褪色。