杂交瘤制备单克隆抗体实验流程

Question

如题所述

Answer 1

在杂交瘤技术中，单克隆抗体的制备流程主要包括抗原的准备、动物免疫、细胞融合、筛选及克隆化、大量生产几个关键步骤。以下是各步骤的具体操作要点。

抗原制备是关键的第一步。确保抗原的纯度越高，制备单克隆抗体的成功率越高。抗原可以是蛋白、多肽、小分子等。选择合适的抗原种类和纯化程度，对后续实验的成功至关重要。

免疫动物选择需考虑与骨髓瘤细胞的品系匹配。通常，小鼠或大鼠作为免疫动物更为普遍。小鼠中，一般选用6-8周龄的雌性Balb/c小鼠。根据所用抗原的特性，免疫方案应有所调整，包括选择适宜的免疫途径、免疫次数、间隔时间以及应用佐剂等。

免疫过程通常在融合前两个月开始，通过多次免疫以刺激动物产生有效的免疫反应。免疫途径通常采用皮下注射、腹腔或静脉注射等体内免疫法。根据动物对特定抗原的应答能力，免疫程序可能有所调整。

细胞融合前的准备工作包括脾淋巴细胞和骨髓瘤细胞的制备。脾淋巴细胞需从已免疫的小鼠（或大鼠）中获取，而骨髓瘤细胞应与免疫动物属同一品系，以提高融合效率。骨髓瘤细胞通常在RPMI1640或DMEM培养基中培养，并添加小牛血清，浓度为10%-20%，细胞浓度调整至104-105/ml，最大浓度不超过106/ml。细胞培养间隔为3-5天，传代比例为1:3-1:10。

为了保证杂交瘤细胞的存活和生长，需加入饲养细胞，如小鼠腹腔细胞、脾脏细胞或胸腺细胞。在细胞融合后选择性培养过程中，饲养细胞的加入有助于杂交瘤细胞的繁殖。

细胞融合的具体操作方法多样，这里介绍一种常用方法。克隆化是使单个细胞无性繁殖以获得杂交瘤细胞团体的过程，通常需要进行2-3次克隆化，有时还需多次。克隆化方法包括有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和FACS分离法。

部分杂交瘤细胞需冻存，以备后续大规模生产单克隆抗体之需。这有助于避免实验过程中的不可预测因素影响实验结果。

单克隆抗体的生产方法包括动物体内生产单抗和体外培养法。动物体内生产单抗方法操作简便、经济且抗体浓度高，通常将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，生长并产生腹水，从而获得单抗。体外培养法可采用单层细胞培养或悬浮培养，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需的单克隆抗体。

抗体的检测方法多样，但ELISA法是最常用的筛选方法，因其快速、简便、特异性和敏感性。此外，还有其他常用方法，具体可根据抗体类型选择。