溶酶体是处理细胞吞噬物的
细胞器,含有高浓度的各种水解酶类,用于细胞内的消化过程。它被一层单位膜单独包围,含有12种以上的酶,其中包括蛋白酶、
核酸降解酶和糖苷酶。
它们都是
消化酶,能分解细胞内的物质,如蛋白质、核酸、多糖类。这种消化酶与细胞内含物的其它部分严格的分开,否则它们将进行自身消化,因此又有“自杀袋”自称。
现在认为溶酶体与卵的受精、形态发生、衰老及某些疾病有关,其分离纯化方法可用分级离心,再用等密度
蔗糖梯度离心纯化,也可用Triton-WR1339处理大鼠,2~4h后杀死,毒性低,比重小的Triton-WR1339集中在溶酶体上,使溶酶体比重便轻,易于分离。
操作方法:
所有操作需在4℃下进行。
1. 制备蔗糖梯度溶液:取带有两个连同小杯的梯度混合器,两个小杯分别装入117ml 2.1mol/L蔗糖和13ml 1.1mol/L的蔗糖。
2. 将大鼠处死取出肾脏,以1:8(重量/体积)比例加入0.3mol/L蔗糖,然后在玻璃匀浆器中匀浆肾脏组织。
3. 以150g ×10min离心,弃沉淀,取上清液9,000g×3min离心,弃上清液,取沉淀。
4. 沉淀从上至下依次为白色、黄褐色、暗褐色三种不同颜色层,上层为膜成分的混合物,中层为线立体部分,最底层则为半纯化的溶酶体。先用 吸管 小心吸掉上层,然后沿管壁加入几毫升0.3mol/L蔗糖,慢慢摇管使界面层悬浮起来弃之。用0.3mol/L蔗糖洗涤1次,底层溶酶体部分悬浮在2.5ml 0.3mol/L蔗糖中。
5.将2ml悬浮的半纯化的溶酶体铺在蔗糖梯度上面,用玻璃棒搅动最上层的梯度,使梯度和溶酶体之间的界面破坏,然后100,000g×150min离心,离心结果可见:梯度溶液分3条明显的带和较少的沉淀。最下层的暗黄色到褐色的带即为纯化的溶酶体。