1937年12月，南京失陷，陈纳德随军撤到汉口。这时中国国民党空军几乎损失殆尽，只得靠苏联援华的飞机来保卫城市。1938年4月29日，是日本天皇的生日。陈纳德和中国、苏联的空军指挥官断定这一天日机会空袭，决定惩罚日本侵略者。为引诱日机来犯，陈要中国和苏联的飞机佯装撤离汉口，飞往南昌。飞机起飞后先在武汉上空盘旋，让人们（包括日本间谍）看到他们撤离，当夜又溜回机场。29日清晨，日机从芜湖机场起飞，轰炸机在战斗机的掩护下飞临武汉上空。陈纳德事先侦得日机只有从芜湖到汉口一个来回的汽油，于是派了20架战斗机在城南拖住日军战斗机，使他们消耗大量汽油，在城市安排40架苏联飞机埋伏在高空，等日机折回芜湖时把轰炸机和战斗机分开，日军战斗机因缺油不敢去保护轰炸机，中苏飞机一队攻击轰炸机，一队攻击战斗机，将39架日机击落36架，只有3架落荒而逃。这就是天皇生日的惨败。
1938年8月，根据宋美龄的要求，陈纳德去昆明筹办航空学校，训练中国飞行员。他在昆明极其简陋的条件下对学员进行严格的训练，不少人中途被淘汰。
1940年后，苏联空军援华人员陆续撤走，中国国民党空军在数量上处于绝对劣势，飞机更为缺乏。这时中国国民党空军和日本空军飞机之比是1：53，日本完全控制了中国的制空权。1940年5月20日，蒋介石召见陈纳德，要他去美国，设法搞到尽可能多的作战物资。陈纳德返美后，虽然他在美国军政界并没什么分量，但他四处宣扬中国人民的抗战，争取各方援助。罗斯福总统的两名助手被陈纳德的游说打动，在罗斯福面前赞成陈纳德关于建立空军的计划。罗斯福决定对华进行军事援助，以把日本拖在中国。陈纳德几经周折，最终得到100架P-40型战斗机。1941年4月14日，罗斯福总统又签署命令，准许预备役军官和退出陆军和海军航空部队的士兵参加赴华的美国志愿队。1941年7月中旬，陈纳德回到中国时，已有68架飞机、110名飞行员、150名机械师和其他一些后勤人员到达中国。
1941年8月1日，蒋介石发布命令，正式成立中国空军美国志愿大队，任命“陈纳德上校为该大队指挥员”。陈纳德立即开始对志愿队成员进行专门训练。当时条件十分艰苦，有几人最终忍不住辞职了。经过几个月的训练，志愿队人员的技战术水平有了大大的提高。1941年11月，陈纳德将美国志愿大队编为3个中队。第1队为“亚当与夏娃队”，该队飞机均有亚当围着苹果追夏娃的图案。第2队为“熊猫队”，该队飞机未画熊猫而画有飞行员的漫画像。第3队为“地狱天使队”，该队飞机均画有姿态各异的裸体天使图案。
1941年12月7日，陈纳德率第1中队和第2中队到昆明。20日，一批日机向云南方向飞来，昆明机场所有的飞机都升空迎击，并出师告捷。日入侵飞机10架，被击落6架，3架负伤。志愿队无1架飞机损失。志愿队的初战胜利，给饱经日机轰炸的昆明人民以极大的鼓舞。当天晚上，昆明各界为美志愿队举行庆功会。报纸头版头条报道战斗经过，称美国志愿队的飞机是“飞行的猛虎” ，从此飞虎队成为志愿队的代称。1941年仰光，协同英军作战。在两个多月的空战中，美英战机对日作战31次，共击落日机217架。
1942年2月3日，宋美龄致电陈纳德，要他出任驻华空军指挥官，军衔升为准将。陈纳德从一个鲜为人知的退役陆军航空上尉，一跃成为世界各国的新闻人物。在美国，太平洋战争开始后，各个战场上的消息都不佳，战争正处于黑暗的时刻。这时突然冒出陈纳德带领一小批“兵油子”取得辉煌胜利的消息，立即引起美国人的轰动和兴奋，陈纳德顷刻之间成为美国家喻户晓的英雄，获得“飞虎将军”的美称。
1942年5月，日军侵占缅甸，继而进犯云南。为阻止日军跨越怒江，陈纳德指挥志愿队连续出击。袭击保山、腾冲、龙陵一带的日军运输队，企图强渡怒江的一队日军在志愿队的轰炸下几乎全军覆没。6月，陈纳德率司令部及2个中队前往桂林。12日，志愿队在桂林上空一举击落日机8架，自己仅受伤1架。桂林人民为之欢欣鼓舞，集资2万元慰劳美飞行员。日军遭受打击后，飞行员上天心慌胆怯，因而要求增派飞机。
1942年7月3日，陈纳德根据美国陆军部和蒋介石的命令，解散美国航空志愿队，而以志愿队部分队员为主组建隶属美国陆军第10航空队的第23大队。美国航空志愿队在中国、缅甸、印度支那作战7个多月，以空中损失12架飞机和地面被摧毁61架的代价，取得击落约150架敌机和摧毁297架敌机的战绩。美国航空志愿队共损失26名飞行员。
美国航空志愿队解散之后，该队所留飞机和人员归并美国陆军航空队第23大队，与派驻中国的第16战斗机中队组成美国空军驻华特遣队，隶属美国陆军第10航空队。陈纳德改任美国驻华航空特遣队司令，军衔仍为准将。日军得知航空志愿队解散的消息，遂将原在南洋的第3飞行师调往中国，企图一举歼灭新组建的美空军。7月份，日空军凭借数量上的优势，对华中的美空军基地发起进攻，面对数倍于己的敌军，陈纳德仍采取志愿队的空中游击战术，以奇袭和机动的作战方式打击日军。到7月底，共击毁日军战斗机2架，轰炸机12架。自己损失战斗机5架，轰炸机1架。特遣队初试锋芒，粉碎了日军一举歼灭在华美空军的企图，也表明该队有能力与数倍于己的日本空军周旋。
1943年3月10日，美国陆军航空队将驻华特遣队编为美国陆军第14航空队，陈纳德晋升少将司令。陈纳德上任后，强烈要求时任美国总统罗斯福加强美国驻华空军力量，夺回中国战场的制空权，并伺机攻击日本本土。他在作战计划和指挥权等问题上与中国战区参谋长和驻华美军司令史迪威将军发生冲突。蒋介石对史迪威也多有不满，因此陈纳德得到蒋的支持。为使陈纳德脱离史迪威的指挥，蒋介石于7月12日致电美国总统罗斯福，要求将陈纳德提升为中国战区空军参谋长。罗斯福采取了折中的办法，同意让陈纳德担任中国国民党空军（而不是中国战区）参谋长。
指挥权限的扩大使陈纳德开始发动计划中的攻势作战。从7月下旬起，美日双方为争夺制空权在华中展开了激烈的空战。陈纳德指挥美空军，依靠“精密的情报通讯网”，仅在7月下旬的8天空战中，美军就击落日机62架，自己仅损失3架。美空军掌握了制空权后，即对长江和北部湾的日舰进行轰炸，并接连袭击了汉口、香港和广州的机场、码头，给日军以沉重打击。1943年11月25日，陈纳德指挥美空军机队远征日军在台湾的机场，击落日战斗机15架，并把机场上的42架日机全部摧毁。
1944年秋，蒋介石与史迪威的矛盾激化。10月18日，罗斯福决定调回史迪威将军，改派魏德迈来华接替他任美军中国战区参谋长。史迪威离华后，马歇尔等人就开始考虑改组在亚洲的航空队，拟将所有驻缅甸和印度的空军调往中国，由驻华的空军司令部统一指挥第10和第14航空队。陈纳德坚决反对这一改组计划，然而他没有得到华盛顿的支持，也没得到蒋介石的支持。1945年7月6日，陈纳德提出辞呈，魏德迈等立即批准并任命了斯通将军接替陈纳德指挥第14航空队。1945年8月1日，陈纳德带着失意离开中国回国。陈纳德在中国8年，协助中国人民抗战，为打败日本侵略者立下汗马功劳。蒋介石和宋美龄设宴为他送行，并授予他中国最高荣誉——青天白日大蓝绶带。
1942年7月以来，陈纳德率领美第14航空队摧毁了2608架敌机，击沉和击伤敌大量商船和44艘军舰，己方损失496架飞机。
陈纳德回国几天后，日本投降了。他对自己不能最后参与受降仪式十分难受。他说：“8年来我唯一的雄心就是打败日本，我很希望亲眼看看日本人正式宣称他们的失败。”
1945年12月，陈纳德重返中国。1946年10月成立了民航空运队，为行政院善后救急总署运送救急物资。1947年，陈纳德与中国女记者陈香梅结婚。1948年后，蒋介石军队在内战中节节失利，陈纳德的民航空运队又帮助蒋介石空运军队、给养。1949年，陈纳德的回忆录《一个战士的道路》在纽约出版。1950年6月，空运队改组为控股公司，陈纳德任公司董事长。1958年7月15日，艾森豪威尔总统要求国会晋升陈纳德为中将。18日，美国国会通过晋升他为空军中将的法案。7月27日，陈纳德因病在华盛顿去世，终年67岁。
注：原设置在台北二二八纪念公园的飞虎队陈纳德将军铜像，后来移到新生公园。 2006年8月，移至花莲空军基地（台湾地下空军基地）四零一联队队史馆与相关文物、资料以纪念馆的形式永久保存，并由陈纳德将军遗孀陈香梅女士由美返台揭幕。
