案发17天后，联邦调查局完成了第一份完整的官方调查报告，并提交给沃伦委员会。联邦调查局在报告中陈述，案发时，凶手共射出了3颗子弹，第一颗射中肯尼迪总统的背部，第二颗射中了康纳利州长，第三颗子弹直接射中肯尼迪总统的头部，并致死。这份调查报告还认为这三颗子弹都是奥斯瓦尔德射出。
后来人们发现，联邦调查局在调查过程中，很大程度上依靠的是特工得到的一份尸检报告。这份尸检报告中显示，第一颗子弹只射入肯尼迪总统的背部数英寸深处，并陷入其中，没有穿出。当联邦调查局完成调查报告后，他们才收到了官方的正式尸检报告，这份报告表明，子弹从肯尼迪总统的背部射入，并从他的喉咙部位穿出。
刺杀肯尼迪的疑凶奥斯瓦尔德被人枪杀后，约翰逊总统亲自任命了一个特别委员会负责彻底调查这一谋杀案件，这个委员会全部由得克萨斯人组成，美国首席法官厄尔·沃伦是这个委员会的主席。他们的调查结果全部收入了《总统特别委员会关于肯尼迪总统被暗杀的调查报告》中，这个具有51本之多的报告也叫做《沃伦报告》。这份报告后来被封存了起来，要在75年后，即公元2038年，待所有与本案有关联的人全部死后，才能公诸于世，这使得肯尼迪遇刺一案变得更加扑朔迷离。
1965年9月25日，经过10个多月的调查，沃伦委员会新闻媒介公布一份调查报告《沃伦报告》（全文： ），宣称枪击肯尼迪是奥斯瓦尔德的个人行为，没有任何更深的政治背景。结论一经公布，一些民间机构宣布要把案件查个水落石出，但这一案件仍然未有进展。
2008年2月18日，达拉斯县地方检察官克雷格·沃特金斯在记者会上出示了12个装满鲁比行刺一案档案和物证的箱子。这些箱子一直储存在达拉斯法庭11楼一间办公室的保险柜中。这批重要物证和档案包括：此案负责人、前达拉斯县地区检察官亨利·韦德的私人信件，鲁比的一个手枪皮套和手枪上的指节钢套，几张鲁比夜总会的会员卡，几件疑似属于鲁比和奥斯瓦尔德的衣物等。
其中有一份奥斯瓦尔德和鲁比之间的谈话记录抄本。该抄本显示，肯尼迪遇刺前约2个月，1963年10月4日，奥斯瓦尔德在鲁比的夜总会中与后者进行了一次秘密会谈。他们当时讨论了刺杀肯尼迪总统的阴谋，希望借此阻止肯尼迪的弟弟、时任司法部长的罗伯特·肯尼迪针对黑手党的严打议程。位于肯尼迪当年遇刺现场附近的“六楼博物馆”馆长加利·麦克指出：“档案上早有记载，奥斯瓦尔德（1963年）10月4日晚上呆在得克萨斯州艾温市，与妻子在一起。”换句话说，奥斯瓦尔德当晚并未前往达拉斯市会晤鲁比。沃特金斯的首席助理摩尔女士则认为，这些谈话抄本可能是前检察官亨利·韦德撰写的一部电影脚本，因为在档案中发现了一份韦德和电影制片人合作时签订的合约。不过，该电影从未被制作完成。联邦调查局（FBI）对这份谈话抄本进行鉴定，结论是伪造。 沃伦委员会认为，奥斯瓦尔德系独自作案，不存在其他任何同谋；杰克·鲁比也是独自作案，枪杀了奥斯瓦尔德。沃伦委员会报告和联邦调查局的调查结果，都一致地认为刺杀现场只射出了三颗子弹。但沃伦委员会认为这三颗子弹中，一颗子弹射偏，一颗子弹从肯尼迪的背部射入，并从喉咙射出，继而射中康纳利州长，致命的第三颗子弹直接击中肯尼迪总统头部。
争论由此产生，很多人质疑刺杀现场射击的子弹的数量。因为如果接受沃伦委员会的调查结论，就意味着一颗长3厘米、直径6.5毫米的步枪子弹，在从德克萨斯州教科书仓库大厦6层窗口射出后，先是穿透肯尼迪总统的脖颈，然后再射穿康纳利州长的胸部和手腕，最后射入州长的大腿里，共造成7处伤口。它穿过了15层衣物、7层皮肤、38厘米厚的人体器官，以及总统的上衣领结和4英寸肋骨的阻碍，并彻底击碎了康纳利州长的桡骨，最终射入他的左腿。在帕克兰医院承载州长的担架上，这颗子弹被发现，而且外壳完整，只是在尾部有一点点变形。沃伦委员会尝试对这颗子弹的运行轨迹进行解释，并逐步衍生出广为人知的“一颗子弹”理论（Single-bullet Theory）。
该理论最有力的证据来自达拉斯市民泽普鲁德的录像，这是现在唯一可以得到的记录整个刺杀过程的最完整录像。从录像中可以看出，肯尼迪总统第一次中枪是在第210帧和225帧之间，而康纳利州长在第240帧之前被射伤，之间最长间隔不超过30帧。联邦调查局的射手们，通过模拟实验，发现犯罪嫌疑人奥斯瓦尔德所使用的曼利舍·卡尔卡诺M91/38栓动步枪“在精准定位情况下，连发两颗子弹之间的最短时间间隔大约为2.25秒”。根据联邦调查局的测算，泽普鲁德这段录像中每秒的时间折合为18.3帧，2.25秒也就是41帧至42帧。因此，奥斯瓦尔德不可能在30帧连发两颗子弹。
通过对伤口的研究，沃伦委员会也试图从理论上证明一颗子弹造成7处伤口的可能性。他们假设子弹从教科书仓库大厦的6层射出58米后，以与水平线呈19°的角度击穿肯尼迪的第六块颈椎骨。在肯尼迪总统脊柱右下方51毫米处，子弹留下了一个4×7毫米的伤口，伤口四周是棕红色和黑色的血瘀痕，也就是通常所说的“擦拭轮”。根据尸检报告，子弹在总统体内造成第一节胸椎的损伤，但是由子弹击中所致，还是由于子弹的冲击力造成还无定论。子弹从肯尼迪右肺叶上方擦过，没有造成穿透。紧接着子弹穿过总统的脖子，从喉结下方射出。总统衬衫衣领上的痕迹，证明了子弹是从后背射入，而不是从喉咙射入。在整个过程中，子弹的速度从射出时的560-610m/s（即米每秒），降到了518m/s。值得一提的是，肯尼迪总统当时还佩戴了领结，子弹打掉领结后，速度迅速降为457m/s，方向也发生偏离。
子弹很快穿越了肯尼迪总统和康纳利州长之间64.77厘米的距离，并从州长右侧腋下射入，留下一个8×15毫米的椭圆形伤口。伤口的形状充分表明，子弹是以很小的角度斜向划入。在州长胸腔内，子弹碎裂，彻底破坏了他的第五条肋骨，事后遗留在州长体内的大量金属残片也佐证了这一点。子弹的主体从州长右乳头下方飞出，留下一条50毫米的伤口。随后子弹射穿康纳利州长的衬衫和外套，出口恰好是在外套右侧翻领的最下方。很快，子弹以274m/s的速度再次进入康纳利的体内。这次是从外侧射入他的右手腕，并击碎了他的右手桡骨。子弹从康纳利州长手心方向射出，此时，子弹的速度已经降至122m/s。子弹没有停止，继而射入了州长左大腿前端，留下一条将近10毫米的外伤，并最终留在州长康纳利左腿的肌肉里。
对于这种解释，沃伦委员会表示，他们“从专家那里获得了有力的证据”。但他们也坦言，委员会内部“对这种可能性”存在“不同意见”，这种理论并不足以得出明确的结论。根据常识判断，按照正常的坐姿，肯尼迪总统和康纳利州长身上的7处伤口并非是在一条直线上。难道这颗神奇的子弹，不仅具有如此强大的穿透力，还可以在空中变换方向？所以“一发子弹”理论也被称为“魔术子弹”理论。
沃伦委员会的调查报告疑点重重，罗伯特·肯尼迪曾在私下里表示沃伦报告“做工低劣”。最被诟病的是报告中的目击者证词，绝大多数证词都是在委员会成员未过半的情况下作出的，全部94份证词只有一个是在委员会全体在场的情况下作出，但这些证词最终都被委员会采信。
包括一些目击者在内的人，声称案发现场至少有4颗子弹被射出。只有这样，才能更完美地解释这7处伤口的来源。联邦调查局的试验已经证明，嫌疑人奥斯瓦尔德不可能在这么短的时间内连发4弹，如果这些证人所说的属实，那就意味一个可怕的结局——还有一个凶手在逍遥法外，并且刺杀并不是奥斯瓦尔德个人行为，而是团伙作案、分工合作、交叉射击——一场事先谋划好的阴谋。
还有一种理论也试图证明第二名枪手的存在，从泽普鲁德的影片中能看到，肯尼迪被最后一发子弹击中头部以后，身体明显地向左后方仰倒。许多人据此认为，这颗致命的子弹从他右前方的草坡飞来，而不是从他后上方的教科书仓库大楼射出。不过创伤弹道专家得出的结论是大脑受创的时刻，神经反射会使背部肌肉收缩，因此不影响子弹从后方射来的结论。
“水门事件”爆发后，参议院的特别委员会（史称“彻奇委员会”）对政府的情报活动展开了大规模的调查。彻奇委员会发现，中央情报局和联邦调查局在肯尼迪遇刺案的调查上存在着重大缺陷，而与此案有紧密关联的证据并没有被提交给沃伦委员会；更为重要的发现是，联邦调查局在调查时，曾被胡佛干涉，也收到了来自“不知名的政府要员”的压力，因此不得不草草结束调查。彻奇委员会的调查在美国人中惊起了一阵波澜，这意味着，很有可能中央情报局和联邦调查局在肯尼迪遇刺案中达成一致，封锁了部分重要信息。
面对着公众的不断质疑，到1976年，国会成立关于约翰·肯尼迪和马丁·路德·金遇刺的特别调查委员会（HSCA）。在肯尼迪事件上，HSCA于1979年公布了调查报告。报告认为，奥斯瓦尔德为刺杀总统的凶手，他共射击了三颗子弹，第二和第三发命中总统，第三发杀死了总统；但声学研究表明，案发现场至少有两名凶手的可能性非常大；肯尼迪总统很有可能是死于一场阴谋，但阴谋的内容，HSCA无法确定；美国司法部、中央情报局、联邦调查局和沃伦委员会都曾企图掩盖一些信息；HSCA认同“一颗子弹”理论。HSCA对美国特勤局的行动也挑出了不少毛病，比如肯尼迪在达拉斯没有得到足够的保护；特勤局收集到的信息没有被充分分析、调查和使用；高速公路上也没有做好足够的准备去保护肯尼迪以防刺客。
对刺杀现场射击的次数，HSCA对现场178名目击证人进行了调查。HSCA发现，目击者对于子弹数量的记忆确实说法不一。但其中132人声称听到3声枪响，当然，也有个别的认为听到了2声、4声或更多。
HSCA后来又提出一种可能：在案发现场，共射击了四颗子弹；新增的这颗子弹来源于隐藏在迪利广场草坡上的枪手。这个推测的证据来源于一部电话录音带，这个录音当时在案发现场附近，被携带在一位骑着摩托车的警官身上。不过，这颗子弹射失了，尽管没有给肯尼迪和康纳利带来伤害，但存在第二名枪手的可能性并没有被封死。
HSCA利用声学手段，对比录音带中的波峰，进而对现场的枪声进行了判别。他们认为，录音带中的第1、2、4次波峰正是从仓库大楼射出的枪声。而第3次波峰，有一半的可能性是发自草坪上的枪声。随后，两名来自皇后学院的声学分析家通过对录音带BBN数据的分析，认为“他们对草坪上发出的枪声有95%以上把握”。当然，反对意见很快也随之而来，有人说第3次波峰其实是摩托的马达声或汽笛声，甚至有人就此发表了一系列相关的学术论文。整个案件显得愈发扑朔迷离。
在《信息自由法案》和《肯尼迪档案法案》推动下，1992年，98%的沃伦委员会档案都已开放。剩余的肯尼迪遇剌案相关档案将于2017年开放。但不包括肯尼迪的尸检照片和X光照片，它们是由肯尼迪家族附加了限制条件于1966年捐给海军档案库的。有少数几件证物失落或被毁了，如轿车在11月24日被清洗了，奥斯瓦尔德的服役档案在1973年被毁了，康纳利的衣服洗了，帽子和手链不见了。
然而，民间对于肯尼迪遇刺案的探索从未停止。探索频道的特别节目《未解的历史：刺杀肯尼迪——不可思议的子弹之外另有悬疑》试图尽可能再现事件发生时的情景。组织者在实验中使用了弹道学研究用人体明胶，其中嵌入了一组类似人类骨骼的物质材料。研究显示，如果子弹在击穿骨骼之前，经由类棉纱质地的物质，得到了一段距离的缓冲，那么还是有可能大体维持形态不变的。
接下来，实验者精确仿照事发现场肯尼迪和康纳利两人的相对位置，放置了两个用于弹道试验及解剖学研究的材料制成的人体模特，它们是用兽皮、明胶以及内置的类骨骼质地注模做成的。一名射术精良的枪手使用与在书库找到的那款枪型号相同的步枪，在等距于书库大楼6层位置的地方射击。弹匣里的弹药是1963年时西部弹药公司（Western Cartridge Company）为卡尔卡诺步枪装备的同一批次6.5x52mm子弹。在高速摄影的追踪下，那颗出膛的子弹几乎完全复制了事件现场受害者负伤时子弹的轨迹。唯一的差别在于，实验中，子弹动能不足，未能穿透康纳利的人体模型代表其大腿的那个部分。之所以如此，是因为子弹在实验中额外击中了模型的另一根“肋骨”，也就是说，模型被击碎了两根肋骨，而康纳利只有一根肋骨受伤。此外，子弹的变形程度也略甚于CE 399号证物子弹，这恐怕还是击碎“两根肋骨”所致。问题是，仅仅一枪，而且子弹大体维持原状，就制造出了与刺杀现场两名受害者所有伤处相同的结果。
1993年，一个名叫戴尔·梅尔斯（Dale Myers）的电脑动画师启动了一个为期10年的计划，试图以3D电脑动画形式完整呈现11月22日肯尼迪遇袭现场。他的成果展现在美国广播公司（ABC）2003年的纪录片《肯尼迪刺杀案揭秘》（The Kennedy Assassination: Beyond Conspiracy）之中，并赢得了艾美奖。
为了制作动画，梅尔斯通过拍摄照片、搜集影像等手段进行采样，并绘制了动画设计蓝图，以期精准重现惨案现场。一个评估机构指出，梅尔斯的作品之于人们再睹暗杀事件的来龙去脉而言，达到了以“全方位的视野，实现历史时空重置的几何完整性”的高度；可以确信，其作品“在完备与细致程度上已然超越了对历史做出公正而准确的描述的要求”。
在这部纪录片中，梅尔斯对泽普鲁德的录像进行了局部检视，证实了关于那唯一一颗子弹的理论。他特别留意到录像中有一处鲜少有人察觉的异常现象。在迪利广场（Dealey Plaza），当肯尼迪的座驾从街牌背后驶出时，那一瞬间——也就是泽普鲁德录像的223与224帧所示——康纳利州长外套的右襟看上去似乎是被一股不知来自何方的力量“突然掀了起来”。据梅尔斯判断，正是那一刻，肯尼迪与康纳利两人同时被奥斯瓦尔德那支步枪打出的那一颗子弹射中了。他还指出，泽普鲁德录像的225至230帧显示，肯尼迪的身影从街牌背后闪出时，他与康纳利同时表现出被子弹击中的痛苦反应。
2013年7月，美国一家电视台根据一名警察对案件的分析和相关书籍，制作了一部融合了记录与戏剧元素的影片。片中暗示，夺走肯尼迪性命的子弹中，有一颗可能是由是特工发射。据澳大利亚一名已经退休的警察麦克・劳伦的研究和美国作家梅宁格的相关书籍，美国ReelzChannel电视台制作了一部纪录片，片中暗示，导致肯尼迪丧命的子弹实际上可能来自中情局特工乔治。澳大利亚警察马克花了四年的时间分析、调查证据。他认为，肯尼迪有可能是死于意外。他说，当时，疑凶奥斯华开了第一枪，坐在后面一辆车的中情局特工乔治用配给的枪支还击，因为对武器不熟悉，加上车子颠簸子弹射偏，打中肯尼迪。 围绕这一案件，美国舆论提出了各种假设。有人认为，这是一起美国中情局和军界中“鹰派”共同策划的政变阴谋；另一些人认为暗杀行动是“黑手党”所为。还有人将肯尼迪的死与玛丽莲·梦露的自杀搅到了一起。
2013年美联社公布的一份民调结果显示，仅有24%的美国人认为当局捕获的枪手李·哈维·奥斯瓦尔德是独自作案，与此形成强烈对比的是，超过半数的美国人相信制造肯尼迪遇刺案的“不是一人、而是多人”。舆论产生了许多关于此案的阴谋论猜想。有“黑帮说”、“中情局说”、“胡佛说”等多种阴谋论。
约翰逊谋杀说
曾经担任尼克松秘书和私人助手的罗·斯通披露前总统理查德·尼克松的观点，尼克松对斯通和其他秘书多次说过，他确信谋杀肯尼迪的幕后主使正是在肯尼迪遇刺后宣誓就任总统的林登·约翰逊。甚至有一次，尼克松告诉斯通，“我和林登·约翰逊的区别是，虽然我们两人都想当总统，但我并没有为此杀人。”
2003年，法国一家电视台的两个记者威廉·雷蒙和贝尔纳·尼古拉在经过长达三年的调查后认定：刺杀肯尼迪总统的幕后指使正是当时的副总统林登·约翰逊。电视台还播出了他们制作的纪录片。
据这个纪录片中叙述，1960年总统大选时，肯尼迪与约翰逊曾为谁能代表民主党竞选总统争得不可开交，由此播下不和的种子。肯尼迪成为美国总统后，约翰逊虽然当了他的副手，却始终生活在压力之下。约翰逊出生于得克萨斯州，当地石油大亨源源不断充实他的秘密金库。这些钱一部分用来挥霍，更多则用做贿赂。司法部长罗伯特·肯尼迪早就对约翰逊进行调查，一些涉及得克萨斯石油大亨的贪污大案，已经隐约露出约翰逊的身影。另外，肯尼迪决定进行财政改革，向国会提交议案准备大幅削减得克萨斯石油大亨在税收上享受的优待。该议案如果获得通过，将使这些石油巨头失去上亿美元的利润，也将影响到约翰逊的秘密金库。1963年年底，快被肯尼迪兄弟逼到绝路的约翰逊不惜铤而走险，借助与联邦调查局局长胡佛的密切关系，一手策划了震惊世界的刺杀肯尼迪事件。
2013年11月美国媒体曝光了当时军方与白宫通讯录音——“请给我有关总统的所有信息。这是情况分析室，我从美联社的公报看到，肯尼迪总统很明显是头部中弹，他脸朝下倒在车后排的座位上，头上有血，肯尼迪夫人一边哭喊着‘哦，不’，一边扶着他的头。”
在军方的通话中，对一些重要人物使用了代码，例如下面的这段通话中所说的志愿者是指肯尼迪遇刺后，随即在空军一号上宣誓就任总统的林登·约翰逊——“我们在等待飞机起飞前的宣誓就职。”
“是志愿者吗？”
“是的，长官。”
卡斯特罗谋杀说
美国中情局一名退休人员在其一本关于肯尼迪遇刺案的书中披露，古巴前领导人菲德尔·卡斯特罗当时对肯尼迪的暗杀事先是知情的。他指出自暗杀发生以来关于卡斯特罗可能涉及当时刺杀案的传言从未中断过，因为肯尼迪是其强硬的反对者。布赖恩·拉特尔是20世纪60年代是中情局古巴分析人员，还曾是CIA驻拉美情报总监，他在新书中指出，他确信卡斯特罗至少事先知道将会发生刺杀事件。其信息来自对前古巴情报官员的采访，有美国机密文件作为支撑。但他表示，他没有证据显示是卡斯特罗命令了此次刺杀或者奥斯瓦尔德是受卡斯特罗控制。拉特尔同时表示，卡斯特罗是希望肯尼迪死的，因为他害怕肯尼迪，“在他的意识里，他可能只是自我防卫。”
卡斯特罗曾否认涉肯尼迪遇刺案。
JIM MARR所作的文章称""肯尼迪被刺杀后短短三年中，18名关键证人相继死亡。其中6人被枪杀，3人死于车祸，2人自杀，1人被割喉，1人被拧断了脖子，5人“自然”死亡，这种巧合的概率为10万万亿分之一。从1963年到1993年，115名相关证人在各种离奇的事件中“自杀”或被杀。"然而经查证所有死亡者中,有的与暗杀或总统的关系相当远,如它包括了新奥尔良市长,空军一号的勤务员和肯尼迪的情妇(全都对暗杀经过毫不知情),而当众议院调查委员会去信给伦敦周日时报询问如何得出10万万亿的机率时,编辑部回答说是搞错了,他们错以为计算的是参加了沃伦调查委员会的人员在三年内死亡18人的可能性.
