石井四郎生于1892年6月25日，原籍日本千叶县山武郡千代田村。家族是当时占有千代田村一带土地的附近豪族，有一家酿酒厂，还经营蚕茧生意。当地农民对石井家族的效忠，使石井四郎在满洲国从事细菌实验研究时，还招募了不少家乡农民，利用这种“愚忠”为其效力。
石井家中子女4人，长男彪雄在日俄战争中战死，次子刚男在陆军工作，三男石井三男是陆军工程师和后来731部队的队长。而石井四郎是四子。长相魁伟，有着日本人罕见的1.8米的高个子。念中小学时，就表现出记忆力很强，据说能在一夜之间背出整本课文，不过与一般小孩不同的是，他有些沉默寡言。
1916年4月，石井四郎进入京都帝国大学医学部，1920年12月毕业，当时28岁的石井四郎决心成为一名陆军军医，为日本和天皇效劳。在日本陆军中，军医的最高军阶为中将，而当时石井四郎的口头禅却是：“我非晋升为大将不可。”所以大学毕业后不到一个月，他便入了近卫步兵第三联队，作为见习士官，开始接受军训。5个月后，于1921年4月9日，石井四郎被任命为军医中尉，分配到近卫师团。
1924年4月，石井四郎以代培学员的身分再入京都帝大，进研究生院学习和研究细菌学、血清学、防疫学、病理学和预防医学，那年，日本暴发了一种奇怪的昏睡病，仅仅几个月，死亡人数就达3000多人。石井四郎提议组建调查小组，查清病因。为了顺利进行调查，他甚至让家人卖掉一部分林地，以凑足经费。他的这种狂热干劲，让一些人感叹不已。以后作为陆军的一个干部、一个职业军人，在军界一直是青云直上，并在1924年8月晋升为陆军军医部大尉。
1927年6月，石井四郎获得微生物学博士学位，被分配到京都卫戍病院，此后，他在学术杂志上发表一系列论文，在医学界渐渐地颇有了名气。促使石井四郎下定决心从事罪恶的细菌战，源自于他发现了二等军医（相当中尉）原田撰写的有关细菌战的报告书，引起他内心的强烈共鸣。无论是原田，还是石井四郎都十分清楚地知道：在1925年日内瓦召开的裁军大会上，宣布化学战和生物战（细菌战）为非法。可是细菌战所具有的杀人威力深深地吸引了石井四郎。在1927年间，石井四郎频繁往来京都和东京之间，远藤三郎（当时为尉官，后累升为陆军中将）曾在当时的日记中记载：“当时石井经常在参谋本部露面，大家都知道他，向各参谋游说细菌战的重要性。”
