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kpnI酶有星活性吗
限制性
酶酶
切DNA有几种方式
答:
大致有三种 I型限制
酶
在识别位点1Kb处随机性进行切割,且识别位点非特异 II型内切酶特异性识别旋转对称序列,且在特定位置进行切割 III型内切酶识别特异序列,在识别序列下游24-26bp处进行切割(非特异)
大肠杆菌中依赖于甲基化的限制系统有哪些?各有何特点?
答:
酶切有标准的反应体系,受末端长度的影响,有位点偏爱性,
在极端非标准条件下会产生星星活性
。通过酶切连接可以增减酶切位点,酶切位点在基因组中的分布是不均匀的。大肠杆菌有三种甲基化酶和三种依赖于甲基化的限制系统。甲基化对限制酶切影响。基因操作常用的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ,T4...
什么是限制性内切核酸
酶
的星号
活性
?受哪些因素影响
答:
酶
的星号
活性
(star activity)限制性内切核酸酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下测定的。当条件改变,许多酶的识别位点会改变,导致识别与切割序列的非特异性,这种现象称为星号活性。影响因素:1、pH大于8.0;2、盐离子浓度小于50mmol/L;3、甘油浓度大于5%;4、含有有机溶剂;5、有替代Mg2+的...
做重组质粒双
酶
切验证,酶切后跑电泳结果条带很模糊是什么原因?
答:
可能
酶
过量或者加的质粒体积大带进去杂质产生星号
活性
。
什么是限制性内切核酸
酶
的星号
活性
?受哪些因素的影响?
答:
【答案】:Ⅱ类限制
酶
虽然识别和切割的序列都
具有
特异性,但是这种特异性受特定条件的限制,即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件发生改变,限制酶的特异性就会松劫,识别的序列和切割都有一些改变。改变后的
活性
通常称第二活性,而将这种因条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示,...
酶
切时,快酶可以和慢酶一起用吗?
答:
不能,二者的
酶
切体系完全不一样,会导致酶活出现各种不可预测性。例如,快酶时间已经到了,慢酶还接着切,就会出现星号
活性
,快酶可能会出现各种非特异酶切。两种酶只能分步酶切,切完一个,纯化后再切另一个。
酶
切产物电泳检测无条带这是怎么回事?
答:
如果
酶
切前有DNA条带,而酶切后没有,很可能是激发了限制酶的星号
活性
,把DNA切碎了。
如何避免星号
活性
答:
可能引起星号
活性
的因素之二:
酶
/DNA浓度比过高(100units/ug DNA)使用尽量少的酶,这样可以避免过度消化,也可以降低甘油浓度。可能引起星号活性的因素之三:非最适缓冲液尽量使用推荐的缓冲液,缓冲液中不同的离子浓度和pH值可导致星号活性。可能引起星号活性的因素之四:反应时间过长使用尽量短的时间...
星号
活性
的含义
答:
Gardner等(11)的研究表明,只要识别中心的四碱基序列(AATT)不出现A/T替换,EcoR I可以切割其它任何单碱基替代序列。大多数星号
活性
是可以控制的,做
酶
切反应时一般不考虑这方面的因素。只要在正常条件下,使用随酶提供的NEBuffer,NEB的酶就不会出现星号活性。下面列出了导致或抑制星号活性的因素。
对核酸进行限制
酶
切时应注意什么
答:
EcoRⅠ在正常情况下识别GAATTC序列发生切割,但如果缓冲液中甘油浓度超过5%,其识别位点发生松动,可在AATT处发生切割,EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做
星活性
,用EcoRⅠ*表示.星活性可造成位点切割机率不等,降解不完全.影响因素:甘油浓度12-20%,
酶
与DNA比例,离子强度,45%聚乙二醇(PEG),有机溶剂,8%二甲基...
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